Insulinproduksjonsteknologi

Forebygging

Insulin er et av hormonene som produseres av selve kroppen, spesielt bukspyttkjertelen. Brudd på sekresjon av dette stoffet fører til fremveksten av en så alvorlig sykdom som diabetes. For behandling med et syntetisk hormon, som lenge isolert fra bukspyttkjertelen av husdyr. Imidlertid har teknologien for å produsere insulin ved hjelp av en svært vanlig bakterie - Escherichia coli eller gjærsvin blitt brukt i ganske lang tid. Ved å bruke denne metoden kan du unngå allergiske reaksjoner forårsaket av fremmed protein, som har en liten forskjell fra mennesket.

Teknologisk ordning

Produksjonsteknologien av insulin inkluderer alle hovedstadiene i produksjonen av bioteknologiske produkter. Resultatet er et krystallinsk sluttprodukt, som deretter brukes til å fremstille injeksjonsløsninger som brukes til behandling av alvorlig diabetes mellitus type I og II. Hovedvirkningen av dette hormonet i kroppen manifesteres i en reduksjon i nivået av glukose inneholdt i blodet.

Stadiene av insulinproduksjonen vil være som følger:

Foreløpige. Den utfører slike operasjoner som forberedelse og rensing av vann og luft, rensing av industrielle lokaler og sterilisering av utstyr, inspeksjon av personell, håndbehandling og utstedelse av sterile sko og klær. Også i det foreløpige stadiet fremstilles den primære kjemiske syntese av molekylkjedene som proteinet er sammensatt av. Kjede A inneholder 21 aminosyrerester, og kjede B inneholder 30 aminosyrer.
Fremstilling av næringsoppløsninger og cellekultur. For å lage en levende celle produserer den nødvendige forbindelsen, blir det tilsvarende gen introdusert. For dette blir plasmidet kuttet av spesielle enzymer, begrensninger, og genene som koder for syntesen av de nødvendige forbindelser, blir sydd inn i den. Deretter returneres den modifiserte plasmid ved hjelp av en mikroinjeksjonsmetode til cellen.
Dyrking av cellesuspensjon. Genetisk modifiserte celler plasseres i en næringsoppløsning, som har alle ingrediensene som er nødvendige for vekst og reproduksjon og gjennomgår sterilisering. Kultiveringen av kulturen foregår i spesielle bioreaktorer, hvor den forrensede luften blir matet. Periodisk tilsettes en viss mengde næringsoppløsning til reaktoren og samtidig trekkes samme volum av cellesuspensjon tilbake.
Allokering av kultur. Separasjonen av væske og cellekultur utføres ved sedimentering (sedimentering) i spesielle sedimentatorer, og deretter filtrering, som gjør det mulig å bevare integriteten til cellene.
Kromatografisk rensing av stoffet. Det utføres på riktig utstyr ved bruk av forskjellige metoder, spesielt frontal, anionbytter og gelpermeasjonskromatografi.
Få proteinmolekyl. På selve biotekstrinnet skjer syntesen av et uproduktet insulinmolekyl. Og de to komponentene i sine kjeder. De er sydd etter oksidasjon og bretting av de oppnådde kjedene, hvilket resulterer i dannelse av disulfidbroer.
Frysetørking i en spesiell ovn, hvorpå det resulterende krystallinske preparatet kontrolleres for overholdelse av standarden, pakket, merket og sendt til forbrukeren.

Vårt firma på gunstige vilkår tilbyr ferdige produksjonslinjer, der all teknologi for insulinproduksjon er fullstendig overholdt. Takket være nøyaktige beregninger, teknisk og informativ støtte, samt personalutdanning innenfor rammen av et omfattende program, vil selskapet være lønnsomt og produktene vil være etterspurt.

Typer insulin og metoder for produksjon

1. Typer insulin

2. Få insulin

Insulin (fra det latinske. Insula - øya) er et peptidhormon som dannes i beta-cellene i bukspyttkjertene i Langerhans. Det har en multifaceted effekt på metabolisme i nesten alle vev.

Hovedfunksjonen til insulin er å sikre permeabiliteten av cellemembraner for glukosemolekyler. I en forenklet form kan vi si at ikke bare karbohydrater, men også næringsstoffer er i sluttbrudd delt inn i glukose, som brukes til å syntetisere andre karbonholdige molekyler, og er den eneste typen drivstoff for cellulære kraftstasjoner - mitokondrier. Uten insulin faller permeabiliteten til cellemembranen til glukose 20 ganger, og cellene dør av sult, og overskudd av sukker oppløst i blodet forgifter kroppen.

Insuffensjonssymptomer på grunn av beta-celledestinasjon - absolutt insulinmangel - er et sentralt element i patogenesen av type 1 diabetes mellitus. Brudd på effekten av insulin på vev - relativ insulinmangel - har et viktig sted i utviklingen av type 2 diabetes.

Insulinfunnets historie er knyttet til navnet til den russiske legen I.M. Sobolev (andre halvdel av 1800-tallet), som viste at nivået av sukker i humant blod er regulert av et spesielt hormon i bukspyttkjertelen.

I 1922 ble insulin isolert fra bukspyttkjertelen av et dyr først introdusert til en ti år gammel diabetiker. Resultatet overgikk alle forventninger, og et år senere løste det amerikanske firmaet Eli Lilly det første dyreinsulinpreparatet.

Etter å ha mottatt den første industrielle sats med insulin de neste årene, har en stor måte å isolere og rense seg på, blitt dekket. Som et resultat ble hormonet tilgjengelig for pasienter med type 1 diabetes.

I 1935 optimaliserte den danske forskeren Hagedorn insulinvirkningen i kroppen ved å foreslå en forlenget medisinering.

De første insulinkrystaller ble oppnådd i 1952, og i 1954 deklarerte den engelske biokjemisten G.Senger dekke insulins struktur. Utviklingen av metoder for rensing av hormonet fra andre hormonelle stoffer og insulinreduksjonsprodukter gjorde det mulig å oppnå homogent insulin, kalt enkomponent insulin.

På begynnelsen av 70-tallet gg. Sovjetiske forskere A. Yudaev og S. Shvachkin foreslo kjemisk syntese av insulin, men implementeringen av denne syntesen i industriell skala var kostbar og ulønnsom.

I fremtiden var det en progressiv forbedring i grad av rensing av insuliner, noe som reduserte problemene som følge av insulinallergier, nedsatt nyrefunksjon, synshemming og immuninsuffisjonsbestandighet. Det mest effektive hormonet var nødvendig for substitusjonsbehandling i diabetes mellitus - homologt insulin, det vil si humant insulin.

På 80-tallet gjorde fremskritt i molekylærbiologi det mulig å syntetisere begge humane insulinkjeder ved bruk av E. coli, som deretter ble kombinert til et biologisk aktivt hormonmolekyl, og rekombinant insulin ble oppnådd ved Institutt for bioorganisk kjemi ved det russiske vitenskapsakademiet ved hjelp av E.coli genetiske stammer.

Bruken av affinitetskromatografi reduserte signifikant innholdet av forurensende proteiner i preparatet med høyere molekylvekt enn insulin. Slike proteiner inkluderer proinsulin og delvis spaltede proinsuliner, som er i stand til å indusere produksjonen av antiinsulinantistoffer.

Bruken av humant insulin fra begynnelsen av behandlingen minimerer forekomsten av allergiske reaksjoner. Humant insulin absorberes raskere og, uavhengig av stoffets form, har en kortere virkningstid enn animalsk insulin. Humane insuliner er mindre immunogener enn svinekjøtt, spesielt blandet oksekjøtt og svineinsulin.

1. Typer insulin

Insulinpreparater varierer i grad av rensing; kilde til kvittering (storfe, svin, menneske); stoffer tilsatt til insulinoppløsningen (forlengelse av dets virkning, bakteriostater, etc.); konsentrasjon; pH-verdi; muligheten for å blande ICD med SDI.

Insulinpreparater varierer fra kilde. Svin- og bovint insulin er forskjellig fra menneske i aminosyresammensetning: bovin i tre aminosyrer og svin i en. Det er ikke overraskende at ved behandling med bovin insulin utvikles bivirkninger mye oftere enn ved behandling med svin eller humant insulin. Disse reaksjonene uttrykkes i immunologisk insulinresistens, insulinallergi, lipodystrofi (endring i subkutant fett på injeksjonsstedet).

Til tross for de åpenbare ulempene med bovint insulin, er det fortsatt mye brukt i verden. Imidlertid er immunologiske mangler av bovint insulin tydelig: Det anbefales under ingen omstendigheter å foreskrive det for pasienter med nylig diagnostisert diabetes mellitus, gravide eller for kortvarig insulinbehandling, for eksempel i perioperativ perioden. De negative egenskapene til bovin insulin blir også bevart når de brukes i en blanding med svin, så blandede (svin + bovin) insuliner bør heller ikke brukes til behandling av disse pasientgruppene.

Humane insulinpreparater for kjemisk struktur er helt identiske med humant insulin.

Hovedproblemet med den biosyntetiske metoden for å oppnå humant insulin er fullstendig rensing av sluttproduktet fra de minste urenheter av de anvendte mikroorganismer og deres metabolske produkter. Nye metoder for kvalitetskontroll sørger for at menneskelig biosyntetisk insulin fra de ovennevnte produsentene er fri for skadelige urenheter. Dermed er deres grad av rensing og glukosesenkende effektivitet de høyeste kravene og er nesten de samme. Eventuelle uønskede bivirkninger, avhengig av urenheter, har ikke disse legemidlene insulin.

For tiden brukes tre typer insuliner i medisinsk praksis:

- kort rekkevidde med rask innflytelse

- gjennomsnittlig varighet av handlingen

- Langvirkende med langsom effekt.

Tabell 1. Kjennetegn ved kommersielle insulinpreparater

Kortvirkende insulin (ICD) - vanlig insulin - er et kortvirkende krystallinsk sinkinnhold som er oppløselig ved nøytral pH, hvis effekt utvikles innen 15 minutter etter subkutan administrering og varer 5-7 timer.

Det første langvarige insulin (SDI) ble opprettet på slutten av 30-tallet, slik at pasientene kunne gjøre injeksjoner sjeldnere enn de gjorde ved bruk av ICD alene, om mulig en gang daglig. For å øke virkningsvarigheten, blir alle andre insulinpreparater modifisert, og når de oppløses i et nøytralt medium, dannes en suspensjon. De inneholder protamin i fosfatbuffer - protamin sink-insulin og NPH (nøytral protamin Hagedorn) - NPH-insulin eller forskjellige konsentrasjoner av sink i acetatbuffer - insulin ultralent, tape, syttil.

Mellomvarende insulinpreparater inneholder protamin, som er et protein av gjennomsnittlig m. 4400, rik på arginin og avledet av regnbueørretmyr. For dannelsen av komplekset krever et forhold mellom protamin og insulin 1:10. Etter subkutan administrering ødelegger proteolytiske enzymer protamin, slik at insulin kan absorberes.

NPH-insulin endrer ikke farmakokinetiske profilen til regulatorisk insulin blandet med det. NPH-insulin er å foretrekke for insulinbånd som en komponent av den gjennomsnittlige virkningsvarigheten i terapeutiske blandinger som inneholder vanlig insulin.

I fosfatbufferen danner alle insuliner enkelt krystaller med sink, men bare bovin insulinkrystaller er tilstrekkelig hydrofobe for å gi en langsom og jevn frigjøring av insulinkarakteristikk for ultralente. Sinkkrystaller av svineinsulin løses raskere, effekten kommer tidligere, varigheten av tiltaket er kortere. Derfor er det ikke noe ultralent medikament som inneholder kun porcin insulin. Monokomponent porcin insulin produseres under navnet insulin suspensjon, insulin nøytral, insulin isofan, insulinaminokinurid.

Insulintape er en blanding av 30% insulin av det semilente (amorfe insulinfelling med sinkioner i acetatbuffer, effekten avhenger relativt raskt) med 70% insulin ultralent (dårlig oppløselig krystallinsk sink-insulin, som har forsinket inntreden og langvarig virkning). Disse to komponentene gir en kombinasjon med relativt rask absorpsjon og stabil langsiktig handling, noe som gjør insulinbåndet til et passende terapeutisk middel.

2. Få insulin

Humant insulin kan produseres på fire måter:

1) fullstendig kjemisk syntese;

2) utvinning fra en persons bukspyttkjertel (begge disse metodene er ikke egnede på grunn av ineffektivitet: utilstrekkelig utvikling av den første metoden og mangel på råmaterialer for masseproduksjon ved den andre metoden);

3) ved en semisyntetisk metode ved bruk av en enzym-kjemisk substitusjon ved posisjon 30 i B-kjeden av aminosyrealaninet i grisinsulin med treonin;

4) biosyntetisk metode for genteknologi teknologi. De to siste metodene tillater å skaffe humaninsulin med høy renhet.

For tiden er humant insulin hovedsakelig oppnådd på to måter: ved å modifisere svinekulinsulin ved en syntetisk-enzymatisk metode og ved en genteknisk metode.

Insulin var det første proteinet oppnådd for kommersielle formål ved bruk av rekombinant DNA-teknologi. Det er to hovedmetoder for å skaffe seg genetisk utviklet humant insulin.

I det første tilfellet produserer separate (forskjellige produsentstammer) begge kjedene etterfulgt av foldingen av molekylet (dannelsen av disulfidbroer) og separasjonen av isoformer.

I det andre preparatet i form av en forløper (proinsulin) etterfulgt av enzymatisk spaltning med trypsin og karboksypteptase B til den aktive form av hormonet. Den mest foretrukne for tiden er å skaffe insulin som en forløper, sikre riktig lukning av disulfidbroer (i tilfelle separat produksjon av kjeder, etterfølgende sykluser av denaturering, separering av isoformer og renaturering utføres).

I begge tilnærminger er det mulig både individuelt å oppnå startkomponentene (A- og B-kjeder eller proinsulin), og som en del av hybridproteiner. I tillegg til A- og B-kjeder eller proinsulin kan det være tilstede i sammensetningen av hybridproteiner:

- proteinbærer, som tilveiebringer transporten av hybridproteinet i periplasmatisk rom av cellen eller dyrkningsmediet;

- affinitetskomponent, som i stor grad letter tilvalget av et hybridprotein.

Samtidig kan begge disse komponentene samtidig forekomme i sammensetningen av hybridproteinet. I tillegg kan prinsippet om flerdimensionalitet brukes ved fremstilling av hybridproteiner (det vil si at flere kopier av målpolypeptidet er tilstede i hybridproteinet), som gjør det mulig å øke utbyttet av målproduktet betydelig.

I Storbritannia ble begge humane insulinkjeder syntetisert ved bruk av E. coli, som deretter ble koblet til et biologisk aktivt hormonmolekyl. For at en encellet organisme skal kunne syntetisere insulinmolekyler på ribosomene, er det nødvendig å forsyne det med det nødvendige programmet, det vil si å introdusere hormongenet for det.

Kjemisk få genprogrammeringsbiosynteseforløperen av insulin eller to gener, og programmer biosyntese av insulinkjedene A og B. separat.

Neste trinn er inkluderingen av genet for insulinprecursor (eller kjedegener separat) i genomet av E. coli, en spesiell stamme av E. coli dyrket under laboratoriebetingelser. Denne oppgaven utføres av genteknologi.

Plasmidet isoleres fra E. coli med det tilsvarende restriksjonsenzym. Det syntetiske genet settes inn i et plasmid (kloning med den funksjonelt aktive C-terminale delen av β-galaktosidase E. coli). Som et resultat får E.coli muligheten til å syntetisere en proteinkjede bestående av galaktosidase og insulin. Syntetiserte polypeptider spaltes kjemisk fra enzymet og deretter renses. I bakterier syntetiseres omtrent 100 000 insulinmolekyler per bakteriecelle.

Naturen til hormonsubstansen produsert av E. coli bestemmes av hvilket gen som settes inn i genomet av den encellede organismen. Hvis insulinforløpergenet klones, syntetiserer bakterien insulinforløperen, som deretter underkastes restriksjonsenzymbehandling for å fjerne forutsetningen med isoleringen av C-peptidet, hvilket resulterer i biologisk aktivt insulin.

For å oppnå renset humant insulin blir hybridproteinet isolert fra biomasse underkastet kjemisk-enzymatisk transformasjon og den tilsvarende kromatografiske rensning (primær gel-penetrerende, anionbytter).

Rekombinant insulin ble oppnådd ved Institute of RAS ved bruk av genetisk konstruerte E. coli stammer. En forløper, et hybridprotein uttrykt i mengden 40% av det totale cellulære protein, som inneholder preproinsulin, frigjøres fra den dyrkede biomasse. Omdannelsen til insulin in vitro foregår i samme rekkefølge som in vivo - det ledende polypeptidet spaltes, preproinsulin omdannes til insulin gjennom oksidative sulfitolysestad, etterfulgt av reduktiv lukning av tre disulfidbindinger og enzymatisk isolering av C-peptidbindingen. Etter en rekke kromatografiske rensninger, inkludert ionbytter, gel og HPLC, oppnås humaninsulin med høy renhet og naturlig aktivitet.

En stamme med en plasmid-innebygd nukleotidsekvens som uttrykker et fusjonsprotein kan anvendes, som består av lineært proinsulin og Staphylococcus aureus protein fragment A festet til dets N-terminus.

Dyrking av mettet biomasse av celler i den rekombinante stammen sikrer starten på produksjonen av hybridproteinet, isoleringen og sekvensiell transformasjon av disse i rør fører til insulin.

En annen måte er også mulig: Det viser seg i et bakterielt ekspresjonssystem et fusjonsrekombinant protein bestående av humant proinsulin og en polyhistidinhale festet til den via en metioninrest. Det isoleres ved bruk av chelatkromatografi på Ni-agarosekolonner fra inklusionslegemer og fordøyes med cyanogenbromid.

Det isolerte protein er S-sulfonert. Kartlegging og massespektrometrisk analyse av det oppnådde proinsulin, renset ved ionebytekromatografi på anionbytter og RP (revers fase) HPLC (høyytelsesvæskekromatografi), viser tilstedeværelsen av disulfidbroer som tilsvarer disulfidbroer av nativt humant proinsulin.

Nylig er det lagt stor vekt på å forenkle prosedyren for å produsere rekombinant insulin ved gentekniske metoder. For eksempel er det mulig å oppnå et fusjonsprotein bestående av lederpeptidet av interleukin 2 festet til N-terminalen av proinsulin via en lysinrest. Proteinet uttrykkes effektivt og lokaliseres i inkluderingslegemer. Etter isolering spaltes proteinet med trypsin for å produsere insulin og C-peptid.

Det resulterende insulin og C-peptid ble renset ved RP HPLC. Når man oppretter fusjonsstrukturer, er masseforholdet mellom bærerproteinet og målpolypeptidet meget signifikant. C-peptider er forbundet med hodestrømsprinsippet ved anvendelse av aminosyreavstandsstykker som bærer Sfi I-restriksjonsstedet og to argininrester i begynnelsen og i enden av spaceren for etterfølgende spaltning av proteinet med trypsin. HPLC-spaltningsprodukter viser at spaltningen av C-peptidet er kvantitativ, og dette gjør det mulig å anvende metoden for multimeriske syntetiske gener til å oppnå målpolypeptider i industriell skala.

Diabetes mellitus er en kronisk sykdom forårsaket av absolutt eller relativ insulinmangel. Det er preget av en dyp metabolsk forstyrrelse av karbohydrater med hyperglykemi og glukosuri, samt andre metabolske forstyrrelser som følge av en rekke genetiske og eksterne faktorer.

Insulin til dags fungerer som en radikal, og i de fleste tilfeller er den eneste måten å opprettholde liv og funksjonshemming hos personer med diabetes. Før mottak og innføring av insulin til klinikken i 1922-1923. Pasienter med diabetes mellitus type jeg ventet på et dødelig utfall i ett til to år fra sykdomsutbruddet, til tross for bruken av de mest svekkende diettene. Pasienter med diabetes mellitus type I trenger livslang erstatningsterapi med insulin. Oppsigelse på grunn av ulike årsaker til den vanlige introduksjonen av insulin fører til rask utvikling av komplikasjoner og pasientens overhengende død.

For tiden er diabetes med hensyn til utbredelse på 3. plass etter kardiovaskulære og onkologiske sykdommer. Ifølge Verdens helseorganisasjon er forekomsten av diabetes blant den voksne befolkningen i de fleste regioner i verden 2-5%, og det er en tendens til å øke antall pasienter nesten to ganger hvert 15. år. Til tross for det åpenbare fremskritt innen helsetjenester, øker antall insulinavhengige pasienter hvert år, og i dag er det bare rundt 2 millioner mennesker i Russland.

Opprettelsen av narkotika av det innenlandske menneskelige genetiske insulin åpner opp nye muligheter for å løse mange problemer med diabetologi i Russland for å redde livene til millioner av mennesker med diabetes.

Bioteknologi: lærebok for ungdomsskoler / red. NS Egorova, V.D. Samuilova. - M.: Higher School, 1987, s. 15-25.

Geneteknisk humant insulin. Forbedre effektiviteten av kromatografisk separasjon ved hjelp av bifunksjonalitetsprinsippet. / Romanchikov, A.B., Yakimov, S.A., Klyushnichenko, V.E., Arutunyan, A.M., Vulfson, A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997 - 23, nr. 2

Glick B., Pasternak J. Molekylærbioteknologi. Prinsipper og anvendelse. M.: Mir, 2002.

Egorov N. S., Samuilov V. D. Moderne metoder for å skape industrielle stammer av mikroorganismer // Bioteknologi. Vol. 2. M.: Higher School, 1988. 208 s.

Immobilisering av trypsin og karboksypeptidase B på modifisert silika og deres bruk ved omdannelse av rekombinant humant proinsulin til insulin. / Kudryavtseva N.E., Zhigis L.S., Zubov V. P., Vulfson A.I., Maltsev K.V., Rumsh L.D. // Kjemisk farmasi. J., 1995 - 29, nr. 1, s. 61 - 64.

Molekylærbiologi. Strukturen og funksjonen av proteiner. / Stepanov V. M. / / Moscow, High School, 1996.

Grunnleggende om farmasøytisk bioteknologi: Studieveiledning / ETC. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhalev. - Rostov-til-Don.: Phoenix; Tomsk: Publishing House NTL, 2006.

Syntese av insulinfragmenter og studier av deres fysisk-kjemiske og immunologiske egenskaper. / Panin L.E., Tuzikov F.V., Poteryaeva ON, Maksyutov A.Z., Tuzikova N.A., Sabirov A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997-23, nr. 12, s. 953-960.

Forskrifter for produksjon av genetisk modifisert insulin

Hjem> Presentasjon> Medisin, Helse

Statlig utdanningsinstitusjon

høyere yrkesopplæring

Kursk stats medisinsk universitet

Forbundsagentur for helse og sosial utvikling

Institutt for farmasøytisk teknologi

å oppnå genetisk modifisert insulin ved hjelp av rDNA-bioteknologi

5 år student 5 grupper

Ph.D., seniorlærer Maravina I.N.

Del I. Egenskaper for sluttproduktet 3

Seksjon II. Kjennetegn ved råvarer 5

Seksjon III. Kjemisk produksjonsskjema 6

Seksjon IV. Teknologisk produksjonsplan 7

Seksjon V. Produksjonsdiagram og spesifikasjon

Seksjon VI. Prosesserklæring 10

Seksjon VII. Analysemetoder 14

Seksjon VIII. Sikkerhet, brannsikkerhet,

industriell sanitæranlegg 16

Seksjon IX. Liste over produksjonsanvisninger 17

Seksjon I. Egenskaper for sluttproduktet

Tørrinsulinbiomasse

Beskrivelse. Insulinløsninger er en klar, fargeløs eller litt gulaktig sur væske (pH 2,0-3,5), som fremstilles ved å fortynne krystallinsk insulin i vann surgjort med saltsyre med tilsetning av glyserol og 0,25-0,30% fenol eller tricresoloppløsning for konservering.

Hypoglykemisk middel, kortvirkende insulin. Interagerer med en bestemt reseptor i den ytre membran av celler og danner et insulin-reseptorkompleks. Gjennom aktivering av cAMP-biosyntese i fettceller og leverceller, eller direkte penetrerende muskelceller, stimulerer insulin-reseptorkomplekset intracellulære prosesser, inkludert syntese av en rekke sentrale enzymer (heksokinase, pyruvatkinase, glykogensyntase, etc.). Nedgangen i blodglukose skyldes økt intracellulær transport, økt absorpsjon og absorpsjon av vev, stimulering av lipogenese, glykogenogenese, proteinsyntese, reduksjon av leverenes glukoseproduksjonshastighet etc. Virkningsvarigheten for insulinpreparater skyldes hovedsakelig absorpsjon faktorer (fra en dose, en metode og et injeksjonssted). Etter p / til begynnelsen av effekten - etter 0,5 timer, maksimal effekt - etter 1-3 timer, varigheten av tiltaket - 8 timer.

Type 1 diabetes mellitus (insulinavhengig). Type 2 diabetes mellitus (ikke-insulinavhengig): resistensnivå mot orale hypoglykemiske midler, delvis resistens mot disse legemidlene (under kombinasjonsbehandling), sammenfallende sykdommer, graviditet.

Ved begynnelsen av behandlingen - synshemming, hevelse i lemmer. Ved innføring av for store doser insulin eller et brudd på kostholdet (hopper over måltider), samt overdreven trening, hypoglykemi (kald svette, blek hud, nervøsitet, tremor, angst, overdreven utmattelse eller svakhet, desorientering, svimmelhet, hodepine, uttalt følelse av sult, midlertidig synshemming, kvalme, takykardi, i alvorlige tilfeller - tap av bevissthet, koma). Systemiske allergiske reaksjoner: økt svette, oppkast, pustevansker, hjertebank, svimmelhet.

Holdbarhet - 1 år fra fremstillingsdato.

Seksjon II. Kjennetegn på råvarer

Kjeder av gener som koder for syntese av kjeder A og B.

Kjemisk syntetisert

Kultur må være ren

Papirposer med fire lag

Stoffer av bomullsbånd

Seksjon III. Kjemisk produksjonsordning

Kjemiske transformasjoner i produksjonen av genetisk modifisert insulin er fraværende.

Seksjon IV. Teknologisk plan for produksjon av insulin

Forberedelse av lokaler og utstyr

Sanitær prosessering produksjon

Klargjøring av teknologisk klær

Syntese av kjeder A og B.

Innføringen av gener i plasmidet

Innføring av r-DNA i permissiv celle

Næringsstoffer forberedelse

Dyrking suspensjonskultur

Få insulinmolekyl

Ifølge FS indikatorer

Instrumentelt produksjonsprogram og utstyrspesifikasjon

1 - Kjemisk reaktor

2 - Innføring av gener i plasmidet

4 - Kontinuerlig steriliseringsenhet

5 - Industriell bioreaktor

6 - Valg av kjeder

7 - Kromatografisk installasjon

8 - få insulinmolekyl

9 - Fryser Tørketrommel

10 - Analytisk tabell

Seksjon VI. Prosessbeskrivelse

BP 1. Vannforberedelse

Membran destillatører er konstruert for å oppnå desalert vann som oppfyller kravene i GOST 6709-97 "Destillert vann". Distillers produktivitet - fra 3 til 15 l / time (laboratorieinstallasjoner i et økonomisk komplett sett), og også fra 5-30 l / t (laboratorieinstallasjoner). Filtreringsprosessen omfatter følgende trinn: forbehandling på aktivert karbon, membranfiltrering og deionisering av vann ved anvendelse av ionebytteharpikser. Forfiltret fjerner suspenderte partikler, klor, høymolekylært organisk materiale og tungmetallioner fra innkommende kranvann. Membranfiltrering er basert på fenomenet omvendt osmose, hvor vann, når det passerer gjennom en semipermeabel membran, renses fra salter oppløst i det, organiske urenheter med lav molekylvekt, samt bakterier og mikroorganismer. På filteret med ionbytterharpikser er det en fullstendig rensing av filtratet fra oppløste salter.

BP 2. Sanitær bearbeiding av produksjon.

BP 2.1. Følgende krav stilles på stedet for fremstilling av sterile doseringsformer:

Må holdes i uklanderlig renslighet, underlagt obligatorisk daglig samt generell rengjøring og periodiske reparasjoner;

Kan bli utsatt for UV-stråling for luftdesinfeksjon ved bruk av stasjonære eller bærbare stråler;

Må ha belysning, temperatur, fuktighet og ventilasjon som ikke har direkte eller indirekte negativ innvirkning på kvaliteten på ferdige produkter;

Må inneholde det minimum som er nødvendig for utførelsen av produksjonsprosessen mengden utstyr og møbler;

Parringen mellom vegger, gulv og tak må ha en avrundet form;

I lokalene til I og II klasser av renslighet bør det ikke være åpen kommunikasjon, luftkanaler;

Lokaler av en høyere klasse av renslighet bør være plassert i et rom med en lavere klasse av renslighet. Tilgang til personell og råvarer til et rent rom utføres kun gjennom luftportene, som er forsynt med tilførsel av steril luft i henhold til "top-down" -ordningen;

Overføringen av ferdigproduktet må utføres ved hjelp av en transportør som passerer gjennom veggene.

BP 2.2. Utarbeidelse av utstyr

Krav til utarbeidelse av utstyr:

Utstyret må utformes og plasseres på en slik måte at drift, vedlikehold og reparasjoner kan utføres utenfor de "rene" lokaler;

Utstyr som brukes til aseptiske forhold, må ha innspillingsenheter for overvåkning av prosessparametere og tilstedeværelsen av alarmenheter for funksjonsfeil.

Utstyret må rengjøres, desinfiseres og om nødvendig steriliseres;

Utstyret må overvåkes for mikrobiologisk renhet;

Utstyrets arbeidsflate skal være glatt, fra ikke-giftig og ikke-korrosivt materiale.

BP 2.3. Personellopplæring

Krav til ansatte:

Personell må ha en viss minimumskunnskap om hygiene, hygiene og GMP-regler;

Ansatte med smittsomme sykdommer, åpne sår på huden og bærere av patogen mikroflora har ikke lov til å jobbe;

Det er forbudt å snakke, spise mat, flytte raskt på arbeidsplassen;

Ta sterkt hensyn til personlig hygiene, fjern kosmetikk fra ansiktet og fjern smykker før du går inn i det "rene" rommet;

Ta en dusj, vask og rengjør hendene med desinfeksjonsmidler, sett på et sett sterilt teknologisk klær og sko.

BP 3. Syntese av kjeder A og B.

Syntese av kjeder utføres ved en kjemisk metode. Kjede A inneholder 21 aminosyrerester, kjede B-30 rester

BP 4. Innføring av gener i plasmidet.

For at plasmidet skal akseptere et fremmedgen, blir dets kjede kuttet med restriksjonsenzymer. For å knytte gener som koder for syntese av kjeder A og B, anvendes oligosakkaridrester av forskjellige lengder - linkere og adaptere. Når molekylet er lukket, kan du legge det inn i en permissiv celle.

BP 5. Innføringen av r-DNA i den permissive cellen.

Innføring av p = DNA i en E. coli-celle utføres ved mikroinjeksjon: et plasmidholdig vektor-DNA injiseres i en E. coli-celle med en spesiell ultratynn glassnål.

TP 6. Fremstilling av næringsmedium

Hovednæringsmediet for dyrking av E. coli-kultur er buljong ifølge Miller. Ingredienser: kaseinhydrolysat, gjærekstrakt, natriumklorid, agar-agar. Den endelige pH-verdien (ved 25 ° C) er 7,0 ± 0,2. Hottinger's buljong brukes også. Ingredienser: Hottinger hydrolysat, natriumklorid, destillert vann.

Sterilisering av næringsmediet utføres i en maskin for kontinuerlig sterilisering - ONS. Næringsmediet passerer suksessivt gjennom varmeseksjonen, holdeseksjonen og kjøleseksjonen.

TP 7. Dyrking av suspensjonskultur

Biokulturkultivering utføres i bioreaktorer, suspensjonskultur som blandes på grunn av tilførsel av luft inn i bioreaktoren. Prosessen utføres i semi-periodisk modus, når en viss mengde frisk næringsmedium blir konstant tilsatt bioreatoren, og samtidig blir det samme volum av cellesuspensjon tatt.

TP 8. Isolering av vevskultur.

Separasjonen av vevskultur fra næringsmediet utføres ved metoden for sedimentering (sedimentering) i sedimenter, en dypere separasjon er gitt ved å filtrere en forsiktig metode for å bevare integriteten til kulturceller.

Insulin renses ved kromatografimetoder: frontal, gelpermeasjon, anionutveksling. Rensing av insulin og dets derivater på sorbenter med sterke kationbytteregenskaper (for eksempel SP-Sepharose FF) kan brukes buffersystemer basert på ammoniumacetat med lavt innhold av urea (opptil 2 M eller mindre).

TP 10. Få insulinmolekyl

Utvalgte og rensede kjeder foldes og oksyderes, noe som sikrer dannelsen av passende disulfidbroer.

Tørking av produktet utføres i en frysetørker.

TP 12. Evaluering av ferdigproduktets kvalitet.

Utseende (som beskrevet), aktivitet (biologisk metode).

UMO 13. Pakking, merking, forsendelse.

Insulinaktivitet måles i virkningsenheter (ED) eller i internasjonale virkemåter (IU - Russisk eller IE - Engelsk eller UI - Fransk). En enhet tilsvarer aktiviteten på 1/24 mg (41,66 μg) krystallinsk insulin.

I 1922 foreslo Frederick Banting at insulinvirkningsenhet bør betraktes som antall kubikkcentimenter av bukspyttkjertelekstrakt som innen 2-4 timer førte til en sunn kanin til hypoglykemi med et SC-nivå på 2,5 mmol / l. Litt senere i samme år foreslo det samme laget en "mus" -enhet - mengden insulin som trengs for å bringe halvparten av eksperimentelle gruppen av mus til kramper (forskerne her opprinnelig handlet analogt med LD50).

Det følgende året vedtok den internasjonale standardiseringskomiteen definisjonen av insulinvirkningsenheten: "Mengden insulin som kreves for å senke blodsukkernivået til det nivået hvor anfall begynner hos kaniner som veier 2 kg, som ikke har blitt matet i 24 timer." Denne enheten, til ære for Toronto-gruppen Banting og Best, ble kalt Toronto-insolvensenheten.

I 1925 ble den første internasjonale standarden innført, som fastslår at en enhet av insulinvirkning er en mengde som tilsvarer 1/8 mg krystallinsk insulin.

På grunn av den store utviklingen i insulinrensing og ulempen ved bruk av en så stor enhet i 1936, godkjente FNs komité en ny internasjonal standard for insulinhandling, som liknet enheten til 1/22 mg krystallinsk insulin. I 1952 ble standarden igjen forandret, og 1 enhet var lik 1 / 24,5 mg krystallinsk insulin, og i 1958 oppstod den fjerde standarden (1 U er lik 1/24 mg krystallinsk insulin). WHO i 1982 gjorde de siste tilpasningene til standarden, som ikke påvirket definisjonen av enheten, men vedrørte bare endringer knyttet til fremveksten av menneskelig genetisk utviklet insulin.

Seksjon VIII. Sikkerhet, brannsikkerhet og

Hver arbeidstaker og ingeniør ved mottak av arbeid må gjennomgå en hovedoppgave. Primær briefing utføres av formann eller mester i henhold til følgende program:

De viktigste bestemmelsene i lovgivningen om arbeidskraft beskyttelse, sikkerhet, industriell sanitæranlegg;

Formålet med og prosedyren for bruk av spesielle klær og personlig verneutstyr

Plikter på arbeidsplassen;

Krav til riktig organisering og vedlikehold av arbeidsplassen;

Generelle elektriske sikkerhetsregler, verdien av ventilasjon og regler for bruk av ventilasjonssystemer;

Kjennskap til teknologisk prosess, utstyrsutstyr og alle farlige gjenstander.

Alt elektrisk utstyr må overholde kravene i "Regler for drift av elektrisk utstyr." Elektrisk utstyr må jordes. Alle produksjons- og bruksområder, installasjoner, anlegg skal forsynes med brannslukningsutstyr og brannslokkingsutstyr.

Opptak av uautoriserte personer inn i butikken er forbudt.

Seksjon IX. Liste over produksjonsinstruksjoner

Arbeidsinstrukser for sanitær behandling av lokaler.

Instruksjoner for sikkerhet, industriell hygiene og brannsikkerhet.

Instruksjoner for forberedelse, levering og kvittering av utstyrsreparasjon.

Instruksjoner for hvordan du mottar råvarer og hjelpematerialer;

Ulykke elimineringsplan.

Instruksjoner for regenerering av løsningen.

Arbeidsinstruksjoner for operatøren for vasking, tørking og sterilisering av flasker.

Instruksjoner for mekanikk for reparasjon og vedlikehold av rørledninger.

Insulinproduksjonsteknologi

INSULIN.docx

Kapittel 1. Litterær gjennomgang

1.3. Sprøyter, pennpenner og insulin dispensere

1.4. Insulin injeksjonsteknikk.............................................

1.5.Faktorer som påvirker insulinabsorpsjon og handling.........

1.6. Komplikasjoner av insulinbehandling............................................

1.7. Insulinemballasje

1.8. Insulin lagring.

1.9. Moderne måter å forbedre insulinbehandling.....

Kapittel 2. Eksperimentell del

Insulin (fra det latinske. Insula - øya) - et peptidhormon, dannes i beta-cellene i øyene av Langerhans i bukspyttkjertelen. Det har en multifaceted effekt på metabolisme i nesten alle vev.

Antall personer med diabetes over hele verden er 120 millioner (2,5% av befolkningen). Hver 10-15 år dobles antall pasienter. Ifølge International Diabetes Institute (Australia), innen 2010 vil det være 220 millioner pasienter i verden. I Ukraina er det omtrent 1 million pasienter, hvorav 10-15% lider av den mest alvorlige insulinavhengige diabetes (type I). Faktisk er antallet pasienter 2-3 ganger mer på grunn av skjulte, udiagnostiserte former.

I 1935 optimaliserte den danske forskeren Hagedorn insulinvirkningen i kroppen ved å foreslå en forlenget medisinering.

På begynnelsen av 70-tallet gg. Sovjetiske forskere A. Yudaev og S. Shvachkin foreslo kjemisk syntese av insulin, men implementeringen av denne syntesen i industriell skala var kostbar og ulønnsom.

Formålet med arbeidet mitt: Studien av insulinpreparater presentert på vårt marked, deres fordeler og ulemper.

Oppgaver: Betraktning av prosessen med å skaffe insulin i industriproduksjon.

Kapittel 1. Litterær gjennomgang

1.1 Få insulin

Humant insulin kan produseres på fire måter:

1) fullstendig kjemisk syntese;

3) ved en semisyntetisk metode ved bruk av en enzym-kjemisk substitusjon ved posisjon 30 i B-kjeden av aminosyrealaninet i grisinsulin med treonin;

4) biosyntetisk metode for genteknologi teknologi. De to siste metodene tillater å skaffe humaninsulin med høy renhet.

Vurder å skaffe insulin biosyntetisk, når det gjelder fordelene ved denne metoden.

Så fordelene med å skaffe insulin biosyntetisk.

Før innføringen av metoden for å produsere insulin ved hjelp av rekombinante mikroorganismer i næringen, var det bare en måte å skaffe insulin - fra bukspyttkjertelen hos storfe og griser. Insulin fra bukspyttkjertelen avviker fra humant insulin med 3 aminosyrerester, og insulin som oppnås fra gris kjertel er bare en aminosyrerest, det vil si at den er nærmere menneskelig insulin. Imidlertid, med innføring av proteiner som avviker i struktur fra humane proteiner, selv i et slikt mindre uttrykk, kan allergiske reaksjoner oppstå. Slike insulin som fremmed protein kan også inaktiveres i blodet av de resulterende antistoffene.

I tillegg, for å oppnå 1 kilo insulin, kreves 35 tusen griser (hvis det er kjent at det årlige behovet for insulin er 1 tonn av legemidlet). På den annen side kan samme mengde insulin oppnås biosyntetisk ved biosyntese i en 25-kubisk fermentor ved anvendelse av den rekombinante mikroorganismen Escherichia coli.

Den biosyntetiske metoden for å oppnå insulin ble påført tidlig på 80-tallet

La oss dvæle på ordningen for produksjon av rekombinant insulin (Eli Lilli-Eli-Lilly, USA):

Fase 1. Ved kjemisk syntese ble nukleotidsekvenser opprettet som koder for dannelsen av A- og B-kjeder, det vil si syntetiske gener ble opprettet.

2. trinn. Hver av de syntetiske gener blir introdusert i et plasmid (et gensyntetiserende streng A blir introdusert i ett plasmid, og et gensyntetiserende streng B innføres i det andre plasmidet).

3. trinn. Skriv inn genet som koder for dannelsen av enzymet betagalaktosidase. Dette genet er inkludert i hvert plasmid for å oppnå kraftig replikasjon av plasmider.

4. trinn. Plasmider blir introdusert i Escherichia coli-cellen - Escherichia coli og to produsentkulturer er oppnådd, en kultur syntetiserer A-kjeden, den andre B-kjeden.

5. trinn. Plasser to kulturer i en fermenter. På onsdag tilsett galaktose, noe som induserer dannelsen av enzymet betagalaktosidase. I dette tilfelle replikerer plasmider aktivt og danner mange kopier av plasmider, og derfor er mange gener som syntetiserer A- og B-kjedene.

6. trinn. Cellene lyser, utskiller A- og B-kjedene, som er forbundet med betagalaktosidase. Alt dette behandles med cyanogenbromid, og A- og B-kjedene spaltes fra beta-galaktosidasen. Deretter gjør ytterligere rensing og utvalg av A- og B-kjeder.

7. trinn. Cysteinrester blir oksidert, bundet og insulin tilberedt.

Insulin som oppnås ved denne ruten er humant insulin i sin struktur, som fra begynnelsen av behandlingen minimerer forekomsten av allergiske reaksjoner.

For å oppnå renset humant insulin blir hybridproteinet isolert fra biomasse utsatt for kjemisk-enzymatisk transformasjon og passende kromatografisk rensing (frontal, gelinntrengning, anionbytter).

Et rekombinant insulin ble oppnådd ved Institutt for det russiske vitenskapsakademiet ved hjelp av genetisk konstruerte E. coli-stammer, metoden består i syntesen av sin biologiske forløper for proinsulin, noe som gjør det mulig å ikke utføre den separate syntese av insulin A- og B-kjeder. For produksjon av pro-insulin-delen av molekylet i E. coli. plasmidet blir introdusert (det oppnås ved å sette inn naturlig eller fremmed DNA - dette er hvordan et rekombinant RNA-molekyl er oppnådd). Plasmidet gir syntese av rekombinant protein, som er en ledersekvens og et fragment av proteinet, så vel som humant proinsulin med metioninrest (aminosyre) mellom dem. Proinsulindelen av molekylet separeres ved behandling med bromcyan i eddiksyre (spaltning utføres selektivt - ved metioninresten). Blandingen (proinsulin del og ledersekvens) separeres ved kromatografi. I den neste fase, i den resulterende sekvens av proinsulin, utføres det korrekte gjensidige arrangement av kjedene A og B, som utføres av den sentrale del - peptid C. I neste trinn isoleres bindende C-peptidet ved en enzymatisk metode. Etter en rekke kromatografiske rensninger, inkludert ionbytte, gel og HPLC, får jeg høyt renhetsinnhold av menneskelig insulin og naturlig aktivitet.

Kvalitetskontrollen av genetisk utviklet insulin innebærer kontroll av ytterligere indikatorer som karakteriserer stabiliteten til rekombinant stamme og plasmid, fraværet av fremmed genetisk materiale i preparatet, identiteten til det uttrykte gen, etc.

1.2 Insulinpreparater

Humane insulinpreparater for kjemisk struktur er helt identiske med humant insulin.

Insulinpreparater, avhengig av begynnelsen og virkningsvarigheten, er delt inn i følgende grupper:
1) insuliner med rask og ultraløs handling;
2) kortvirkende insuliner ("enkle" insuliner);
3) Insuliner med middels varighet ("mellomliggende" insuliner);
4) langvirkende insuliner;
5) "blandede" insuliner - en kombinasjon av insuliner med forskjellig virkningsvarighet.

Antall insulinpreparater med forskjellige navn er flere dusin, og nye insulinnavn fra ulike utenlandske, og i de senere år er det innenlandske farmasøytiske selskaper lagt til årlig.

Rask og ultralyd insuliner

De raske og ultraløse insuliner inkluderer for tiden tre nye legemidler - lispro (humalog), aspart (novoid, novolog) og glulissin (apidra). Deres særegenhet er i den raskere begynnelsen og slutten av handlingen i sammenligning med det vanlige "enkle" personinsulinet. Den hurtige starten på glukose-senkende effekten av nye insuliner skyldes deres akselerert absorpsjon fra subkutant fett. Egenheten ved nye insuliner gjør det mulig å redusere tiden mellom injeksjonene og matinntaket, redusere nivået av næringsglykemi og redusere forekomsten av hypoglykemi.

Virkningen av virkningen lizpro, aspart og glulisin ligger i området fra 5 til 10-15 minutter, maksimal effekt (peak action) - etter 60 minutter, varigheten av tiltaket - 3 - 5 timer. Disse insulinene administreres 5 til 15 minutter før et måltid eller umiddelbart før det. Det har blitt fastslått at administrering av insulin lispro umiddelbart etter et måltid også gir god glykemisk kontroll. Imidlertid er det viktig å huske at administrering av disse insulinene 20 til 30 minutter før et måltid kan føre til hypoglykemi.

Pasienter som bytter til introduksjonen av disse insulinene må kontrollere glykemiske nivåer oftere til de lærer å korrelere mengden av karbohydrater som forbrukes og dosen av insulin. Dermed blir dosene av legemidler satt i hvert enkelt tilfelle individuelt.

Hvis bare Humalog (Insulin lispro), brukes en ny rask eller nybegynner (insulin aspart), eller apidra (insulin glulisin), kan de administreres 4-6 ganger daglig, og i kombinasjon med langtidsvirkende insuliner 3 ganger daglig. Overdreven enkeltdose på 40 U er tillatt i unntakstilfeller. Disse insulinene, tilgjengelige i hetteglass, kan blandes i samme sprøyte med humane insulinpreparater med lengre varighet. Når dette høyhastighetsinsulinet oppsamles i sprøyten først. Injeksjon er ønskelig å gjøre umiddelbart etter blanding. Disse insuliner produsert i patroner (spesielle ermer) er ikke ment for fremstilling av blandinger med noe annet insulin.

Dette er viktig!
Nye høyhastighetsisoliner er praktiske for pasienter som leder en aktiv livsstil, deres bruk anbefales for akutte infeksjoner, følelsesmessig stress, økning av karbohydrater i mat, bruk av medisiner som fremmer hyperglykemi (skjoldbruskkjertelhormoner, kortikosteroider - prednisolon etc.), med andre intoleranser insulinpreparater eller post-næringshypiglykemi, som er dårlig egnet til virkningen av andre insuliner. Det bør legges vekt på at hurtigvirkende insuliner skal brukes i direkte forbindelse med matinntaket.

Insulinproduksjonsteknologi

Teknologisk ordning

Typer insulin og metoder for produksjon

Forskrifter for produksjon av genetisk modifisert insulin

Hjem> Presentasjon> Medisin, Helse

Insulinproduksjonsteknologi

INSULIN.docx

Les Mer Om Diabetes

Symptomer På Diabetes

Glykemisk Indeks