Insulinproduksjonsteknologi

Analyser

Insulin er et av hormonene som produseres av selve kroppen, spesielt bukspyttkjertelen. Brudd på sekresjon av dette stoffet fører til fremveksten av en så alvorlig sykdom som diabetes. For behandling med et syntetisk hormon, som lenge isolert fra bukspyttkjertelen av husdyr. Imidlertid har teknologien for å produsere insulin ved hjelp av en svært vanlig bakterie - Escherichia coli eller gjærsvin blitt brukt i ganske lang tid. Ved å bruke denne metoden kan du unngå allergiske reaksjoner forårsaket av fremmed protein, som har en liten forskjell fra mennesket.

Teknologisk ordning

Produksjonsteknologien av insulin inkluderer alle hovedstadiene i produksjonen av bioteknologiske produkter. Resultatet er et krystallinsk sluttprodukt, som deretter brukes til å fremstille injeksjonsløsninger som brukes til behandling av alvorlig diabetes mellitus type I og II. Hovedvirkningen av dette hormonet i kroppen manifesteres i en reduksjon i nivået av glukose inneholdt i blodet.

Stadiene av insulinproduksjonen vil være som følger:

Foreløpige. Den utfører slike operasjoner som forberedelse og rensing av vann og luft, rensing av industrielle lokaler og sterilisering av utstyr, inspeksjon av personell, håndbehandling og utstedelse av sterile sko og klær. Også i det foreløpige stadiet fremstilles den primære kjemiske syntese av molekylkjedene som proteinet er sammensatt av. Kjede A inneholder 21 aminosyrerester, og kjede B inneholder 30 aminosyrer.
Fremstilling av næringsoppløsninger og cellekultur. For å lage en levende celle produserer den nødvendige forbindelsen, blir det tilsvarende gen introdusert. For dette blir plasmidet kuttet av spesielle enzymer, begrensninger, og genene som koder for syntesen av de nødvendige forbindelser, blir sydd inn i den. Deretter returneres den modifiserte plasmid ved hjelp av en mikroinjeksjonsmetode til cellen.
Dyrking av cellesuspensjon. Genetisk modifiserte celler plasseres i en næringsoppløsning, som har alle ingrediensene som er nødvendige for vekst og reproduksjon og gjennomgår sterilisering. Kultiveringen av kulturen foregår i spesielle bioreaktorer, hvor den forrensede luften blir matet. Periodisk tilsettes en viss mengde næringsoppløsning til reaktoren og samtidig trekkes samme volum av cellesuspensjon tilbake.
Allokering av kultur. Separasjonen av væske og cellekultur utføres ved sedimentering (sedimentering) i spesielle sedimentatorer, og deretter filtrering, som gjør det mulig å bevare integriteten til cellene.
Kromatografisk rensing av stoffet. Det utføres på riktig utstyr ved bruk av forskjellige metoder, spesielt frontal, anionbytter og gelpermeasjonskromatografi.
Få proteinmolekyl. På selve biotekstrinnet skjer syntesen av et uproduktet insulinmolekyl. Og de to komponentene i sine kjeder. De er sydd etter oksidasjon og bretting av de oppnådde kjedene, hvilket resulterer i dannelse av disulfidbroer.
Frysetørking i en spesiell ovn, hvorpå det resulterende krystallinske preparatet kontrolleres for overholdelse av standarden, pakket, merket og sendt til forbrukeren.

Vårt firma på gunstige vilkår tilbyr ferdige produksjonslinjer, der all teknologi for insulinproduksjon er fullstendig overholdt. Takket være nøyaktige beregninger, teknisk og informativ støtte, samt personalutdanning innenfor rammen av et omfattende program, vil selskapet være lønnsomt og produktene vil være etterspurt.

Insulinfunn

I dag påvirker diabetes mer enn 400 millioner mennesker på planeten, som er ca 8% av den voksne befolkningen i verden. Ifølge statsregistret lider mer enn 3,3 millioner mennesker av diabetes i Russland (omtrent 300 tusen mennesker lider av type 1 diabetes, og om lag 3 millioner mennesker lider av type 2 diabetes). Imidlertid er disse tallene usannsynlig å gjenspeile den virkelige situasjonen. Alle disse menneskene, som lever hver dag, forstår at deres liv er avhengig av insulin.

De første forsøkene på å kurere diabetes ble gjort før vår tid. Gamle greske og romerske leger brukt til denne massasjen, gymnastikk, bad, aromaterapi og mye mer. På 1800-tallet ble det utviklet et lavt karbohydrat kjøtt diett for diabetikere. Det første forsøket på å behandle diabetes med insulininjeksjoner ble laget i 1921. Kanadisk forsker Frederick Banting ble den første personen som brukte insulinhormon til å kontrollere diabetes. Han var bare 32 koder da han mottok Nobelprisen i medisin. Han opprettet stoffet effektivt og uten bivirkninger reduserte nivået av glukose fra 28,9 til 6,7 mmol / l. Dette stoffet ga håp for livet til mange.

I 1869 oppdaget forskeren Paul Langergans grupper av celler i bukspyttkjertelen, som senere ble kalt "Langerhansøyene". Insulin ble deretter isolert fra cellene i disse øyene. Insulin er et hormon som regulerer metabolismen, hovedsakelig av karbohydrater (sukkerarter), men også fett og proteiner. I diabetes på grunn av utilstrekkelig insulineksponering forekommer en kompleks metabolsk lidelse, blodsukkernivået øker (hyperglykemi), sukker utskilles i urinen (glykosuri), og sure produkter med nedsatt fettforbrenning forekommer i blodketonkroppene (ketoacidose).

Etter oppdagelsen av insulin begynte mange forskere å utvikle metoder for rensing av dette stoffet, siden det er urenheter som har en skadelig effekt på en svekket kropp.

Agilent Technologies er verdensledende innen analytisk utstyr. Enheter for kromatografisk og spektralanalyse i mer enn et år har hjulpet forskere over hele verden med å løse de viktigste problemene med legemidler. Insulinrenhetskontroll er ikke noe unntak. Tidligere ble klassisk væskekromatografi anvendt til disse formål, mens man oppnådde ganske akseptable resultater:

Etter mye forskning viste forskerne at det dannede insulinpolypeptidet med en molekylvekt på ca. 6000, er effektivt identifisert ved hjelp av de nyeste utviklingene innen eksklusjonskromatografi.

Med denne nye metoden kan man sammenligne "godt insulin", som ble lagret under anbefalte forhold og "dårlig insulin". Når to kromatogrammer ble overlappet på hverandre, viste det seg at i insulinpreparatet, som ble lagret under ugunstige forhold, ble målmolekylet ødelagt, og i stedet for det ble dekomponeringsprodukter identifisert på kromatogrammet.

Utvikling og forening av metoder for analyse og standardisering av insulinpreparater ved bruk av reversertfase høytrykksvæskekromatografi (RP HPLC) Pihtar Anatoly Vasilyevich

Denne avhandlingen skal gå til biblioteket i nær fremtid.
Gi beskjed om opptak

Avhandlingen - 480 rubler., Levering 10 minutter, døgnet rundt, syv dager i uken og helligdager.

Abstrakt - 240 rubler, levering 1-3 timer, fra 10-19 (Moskva tid), unntatt søndag

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Utvikling og forening av metoder for analyse og standardisering av insulinpreparater ved bruk av reversertfase høytrykksvæskekromatografi (RP HPLC): avhandling. Kandidat i farmasøytiske fag: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Beskyttelsessted: Moscow Medical Academy "].- Moskva, 2005.- 139 s.: Il.

Innhold for avhandlingen

KAPITTEL 1. Gjennomgang av litteratur 11

1. Insulins rolle i behandlingen av diabetes mellitus 11

2. Biosyntese og biologisk virkning av insulin 12

3. Generelle egenskaper av insulinets fysisk-kjemiske og farmasøytiske egenskaper 15

4. Insulinpreparater 24

5. Produksjonsmetoder, standardisering og kvalitetskontroll av insulinpreparater 31

6. Bruken av HPLC i farmasøytisk analyse av insulin. 46

KAPITTEL 2. Problemeretning 50

KAPITTEL 3. Studie av påvirkning av ulike faktorer på kromatografisk oppførsel av insulin under betingelsene for RP HPLC 56

1. Metoder og materialer 57

2. Diskusjon av resultatene 62

2.1. Påvirkningen av sammensetningen av bufferoppløsningen 62

2.2. Effekten av natriumsulfatkonsentrasjon 68

2.3. Effekt av kromatografisk kolonnen temperatur 70

2.4. Effekt av organisk modifikator 75

2.5. Innflytelsen av lengden av alkylradikalet i den podede fase 80

2.6. Påvirkningen av lengden av kromatografisk kolonne 80

KAPITTEL 4. Forbedring av farmakopémetoder for analyse av insulinpreparater basert på bruk av RP HPLC 82

1. Valg av de optimale forholdene for kromatografisk bestemmelse av insulin og dets urenheter i medisinske preparater 82

2. Metrologiske egenskaper ved fremgangsmåten 84

3. Anvendelse av den utviklede metodikken for testing av offisielle insulinpreparater 95

KAPITTEL 5. Utvikling av metoder for analyse av injiserbare doseringsformer av isophan-insulin basert på PF HPLC-metoden 107

1. Valget av betingelser for kromatografisk bestemmelse av protamin i doseringsformene av isophan-insulin 110

2. Studie av kromatografiske profiler av protaminer isolert fra forskjellige fiskearter 121

3. Fremgangsmåte for bestemmelse av protamin i isofan-insulinpreparater 123

4. Validering av den utviklede metodikken 125

Generelle konklusjoner 136

Referanser 139

Generelle egenskaper av insulinets fysisk-kjemiske og farmasøytiske egenskaper

Fra et kjemisk synspunkt er insulin et lite kuleformet protein med en molekylvekt på opptil 6000 Da. Samtidig bør det bemerkes at insulin er et vanlig navn for en hel familie av homologe proteiner av naturlig og kunstig opprinnelse med en felles karakteristisk biologisk aktivitet. Proteinegenskapen til insulin ble etablert i 1928 [52]. Det er blant proteiner som produserer biuretreaksjonen og Pauli-reaksjonen. Insulinstrukturen ble fullt etablert tidlig på 50-tallet. Den grunnleggende kjemiske sammensetningen av insuliner av forskjellig opprinnelse er preget av tallene gitt i tabell 1 [40].

Aminosyresammensetning. De fleste insulinmolekyler inneholder 51 aminosyrerester, blant hvilke er 17 aminosyrer funnet i mest kjente proteiner.

Et karakteristisk trekk ved aminosyresammensetningen av bovin, porcin og humant insulin er tryptofan og metionin. Aminosyresammensetningen av disse typer insulin er presentert i tabell 2 [40,46].

Invariant for alle typer insulin er innholdet av cystin (6 halv-cysteinrester). I tillegg inneholder insulinmolekylet av alle typer 6 amidgrupper (asparagin, glutamin).

Når insulin slippes, sammen med hovedfraksjonen, kan man se fraksjoner av deamiderte insulinformer. I det sure miljøet, i deamidasjonsprosessen, kan alle 6 amidgruppene gradvis spaltes, og den elektroforetiske og kromatografiske mobiliteten for insulin endres [40]. Dannelsen av deamiderte former av insulin kan bedømmes av resultatene av bestemmelsen av ammoniakk. For helamidformen av insulin bestemmes 6 mol ammoniakk per 1 mol protein, for deamiderte former kan denne verdien være fra 5 til 0.

Den primære strukturen av insulin. Den primære strukturen av insulin ble dechifrert av Sanger-gruppen i 1945-1955. Ved hjelp av en rekke kromatografiske metoder som gjorde det mulig å skille og identifisere forskjellige peptider, aminosyrer og deres derivater, var Sanger i stand til å etablere den primære strukturen av bovin insulin [130,131,132,133,134,135]. Videre studier av insuliner av forskjellig opprinnelse ved hjelp av en rekke fysisk-kjemiske metoder, inkludert Edman-metoden for å bestemme den fulle aminosyresekvensen i lange peptider, bekreftet funnene fra Sanger og hans medforfattere på insulinets struktur [bb].

Hittil har primærstrukturen for insulin blitt bestemt hos representanter for 24 arter som tilhører 4 klasser dyr: pattedyr, fugler, fisk og syklostomer [14]. Forskning på insulin av forskjellig opprinnelse fortsetter [71,72,73].

Strukturen av insulin i forskjellige dyr er lik, men ikke identisk. I sin primære struktur er humant insulin lik gris, hund, spermhval og kaninsubuliner, forskjellig bare i en aminosyre [40]. Det adskiller seg fra storfeinsulin med tre aminosyrer. I større grad er humant insulin ikke ligner på insulin fra Guineas gris, fugler og fisk [40]. Forskjeller i aminosyresekvensen av humane, gris og storfe insuliner er vist i tabell 3.

Til tross for strukturelle forskjeller har alle typer insuliner tilsvarende biologisk aktivitet, dvs. forårsake hypoglykemisk effekt. Størrelsen på den viste biologiske aktiviteten avhenger imidlertid sterkt av arten og ligger i området 11 IE / mg (torskinsulin fra Nordsjøen) til 62 IE / mg (kalkun og kyllinsulin), mens aktiviteten av humant insulin er omtrent 25-30 IE / mg [40]. Jo større interspesifikasjonene er, desto større er forskjellen i den biologiske aktiviteten til det tilsvarende insulin.

Et funksjonelt aktivt insulinmolekyl består av to polypeptidkjeder (A- og B-kjeder) bundet av disulfidbindinger; ett bindingsforbindelse dannes av de syvende aminosyrerester av begge kjedene, den andre disulfidbindingen dannes av den 20. resten av A-kjeden og den 19. resten av B-kjeden (figur 2). I tillegg er det en tredje disulfidbinding i insulinmolekylet, som er intrachain og forbinder den 6. og 11. A-kjedenresiduen [59,117].

Sekundær struktur Ved hjelp av ulike fysisk-kjemiske og fysiske forskningsmetoder ble det vist at insulinmolekylet har en svært bestilt romlig struktur (konformasjon), som bidrar til implementering av spesifikke biologiske funksjoner [14]. I molekylet av naturlig insulin er både cc-helix og p-fold ark tilstede samtidig. I tillegg er det områder med uordnet struktur og struktur <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Når en sur oppløsning av insulin (pH 2,3-2,5) oppvarmes til en temperatur på +100 ° C og raskt avkjøles til -80 ° C dannes det såkalte fibrillære insulin - en helt inaktiv form for hormonet [27]. Innføringen av fibrillære insulinfibre i en oppløsning av aktivt insulin fører til spontan kvantitativ utfelling av insulin i form av fibriller [14,17].

Produksjonsmetoder, standardisering og kvalitetskontroll av insulinpreparater

Oppnå dyreinsulinart. Industriell produksjon av biff og svinekulinsyre ble etablert nesten samtidig i en rekke land, kort tid etter oppdagelsen av insulin i 1921 [63]. Siden da har konseptet med å skaffe insulin forblitt nesten uendret (tabell b) [17, 18]. Råmaterialene til produksjon av dyrearter av insulin er bukspyttkjertelen av slaktekjøtt som brukes til mat.

Den viktigste oppgaven ved produksjon av insulin er rensing - utslipp av stoffer fra beslektede urenheter, noe som reduserer den biologiske aktiviteten, forårsaker immunologiske reaksjoner, eller er potensielt farlig for pasientens helse. For eksempel, etter flere år med å bruke dårlig renset insulin i pasientens blod, kan det være opptil 5000 IE insulin bundet til antistoffer. Antistoffer mot insulin påvirker signifikant profilen av sin virkning og bidrar dermed til det labile løpet av diabetes.

Den første fremgangsmåten for rensing av insulin var omkrystallisering i nærvær av sinksalter. I 1945 ble det vist at den syvfoldige omkrystallisering av insulin signifikant reduserer nivået av allergiske reaksjoner hos pasienter, sammenlignet med de offisielle insulinpreparatene på den tiden [63].

motstrømsekstraksjon (PE), fordelingskromatografi (PX), ionebytterkromatografi (IOC) diskelek-troforeza (DEF), og geleksklusjonskromatografi (GEH) [63] ved anvendelse av en rekke metoder heterogenitet insulin prøver etter krystallisasjon og en enkelt krystallisasjonstrinn viser.

Det har vist seg at de store forurensninger er samtidig insulin: proinsulin, mellomprodukter, kovalent dimer insulin, monodezamidoinsulin, og monoarginin monoetilinsulin, så vel som en rekke høymolekylære forbindelser ikke er naturlig insulin. Generaliserte konklusjoner fra studiene, tar hensyn til informasjon om den immunologiske aktivitet påvist forurensninger [138] ble det konkludert med at behovet for ytterligere rensing av insulin stoffer, slik at analysemetoder og DEF GEH oppdaget en komponent - det tilsvarende insulin.

For å løse problemet med rensing av insulin i 1950 ble HEC-metoden foreslått, og i 1970 anionbytterkromatografi (AOX) -metode. Det ble funnet at insulin, renset ved AOX-metoden, inneholder ca. 500 ppm (deler per million) av urenheter med proinsulinaktivitet [137]. Ytterligere rensing av insulin ved bruk av høytrykksvätskekromatografi på reverserte faser (RP HPLC) reduserer innholdet av immunogene fraksjoner til grensen for deteksjonen [63].

En gjennomgang av dagens utvikling innen kromatografisk rensing av insulin er presentert i [96]. Insulin, renset, sekvensielt, ved hjelp av IOC og GEC, kalles monokomponent insulin [63]. Får menneskelig insulin. Søket etter metoder for å oppnå humant insulin var på grunn av to omstendigheter. På den ene siden, det haster med råmaterialet problemet i tilfelle produksjon av animalsk insulin, derimot, den raske utviklingen av vitenskap på dette området ga en reell mulighet til å bringe ideen til liv. I 1979 og 1981 nesten samtidig ble to metoder for å oppnå humant insulin utviklet - biosyntetisk og semisyntetisk [102.108]. I 1981 begynte selskapet Novo Nordisk for første gang i verden seriell produksjon av menneskelig semi-syntetisk insulin. Metoden som brukes av selskapet er basert på den enzymatiske og kjemiske erstatning av Al i porcin insulinmolekylet med resten av Tre [61]. Denne metoden er direkte avhengig av å oppnå den nødvendige mengden av svinsulin, noe som reduserer sin økonomiske verdi. Muligheten for å oppnå humant insulin ved hjelp av biosyntetisk metode, oppsto med utvikling av rekombinant DNA-teknologi [10]. Arbeidet med genmodifisert insulinproduksjon begynte for 25 år siden. I 1978 ble det rapportert at en stamme av E. coli produserende rotteproinsolering ble oppnådd. I 1979 kunne Genentechs studier klone inn i E. coli generene som koder for aminosyresekvenser for. insulinkjedene A og B inkludert i p-halo-tacidase-regionen i pBR322-plasmidet [10, 102]. I 1981 ble det syntetisert proinsulingenet analog - mini-proinsulin-C, karakterisert ved at 35-ulcerøs C-peptid-segmentet er erstattet med seks aminosyrer: arg-arg-gly-ser-lys-arg, og viser dens ekspresjon i E. coli. I 1982 startet Eli Lilly verdens første industrielle produksjon av humant insulin ved hjelp av to kjedeteknologier utviklet i samarbeid med Genentech [102]. For tiden er muligheten for å oppnå humant insulin ved hjelp av ulike ekspresjonssystemer vist [3,10,101,102]. Fra et økonomisk synspunkt er bruk av genetisk modifiserte stammer av gram-positive E. coli-bakterier, hvorav mange anses for overproducere, av særlig interesse [3]. Samtidig ble betydelige fremskritt oppnådd med Saccharomices cerevisiae gjærceller [3,75]. Tabell 7 viser de viktigste, felles for ulike metoder for å produsere rekombinant humant insulin, stadiene av den teknologiske prosessen [3,10,63].

Anvendelse av den utviklede metodikken for testing av offisielle insulinpreparater

Høytrykksvæskekromatografi (HPLC) er en variant av kolonnevæskekromatografi der mobilfaseluenten passerer gjennom sorbenten som fyller kolonnen ved høy hastighet på grunn av betydelig trykk (opptil 400x105 Pa) ved inngangen til kolonnen [11].

Som en måte å analysere komplekse blandinger av stoffer, oppstod HPLC litt over 30 år siden. Bruken av sorbenter med en partikkeldiameter på 3-10 um forårsaket en kraftig økning i effektiviteten av kromatografisk separasjon sammenlignet med den klassiske versjonen av kolonnevæskekromatografi. Derfor refereres HPLC ofte til høyytelsesvæskekromatografi (HPLC). Instrumentale egenskaper ved bruk av HPLC er beskrevet i detalj i mange håndbøker [49.50] og i de relevante delene av den ledende farmakopien [79,150]. For HPLC har et bredt spekter av sorbenter blitt utviklet og produsert. Ifølge forfatterne av undersøkelsen [51] produserer ca 100 firmaer over hele verden mer enn 300 typer sorbentnavn. Historien, nåværende tilstand og utsiktene for utviklingen av metoden er omtalt i vurderinger [51] og [77.78].

I sine forskjellige varianter er HPLC-metoden mye brukt i farmasøytisk analyse (produksjonskontroll og testing av legemiddelkvalitet). Metoden er inkludert i alle ledende farmakopéer i verden. Denne metoden er mest fullstendig beskrevet i europeiske og amerikanske farmakopéer. HPLC brukes til å identifisere medisiner for å bestemme renhet, molekylvekt fraksjonal sammensetning og kvantitativ analyse. I US Pharmacopoeia 28 ed. ca 30% av private artikler involverer bruk av HPLC. I den europeiske farmakopé 4. utg. denne tallet er ca 40%.

Den første kromatografiske metoden for insulintesting var lavtrykksgelekslingsvæskekromatografi (GE ZhND). Prinsippet for separasjon under betingelsene for HPLC er basert på den forskjellige evne til molekyler av forskjellige størrelser til å trenge inn i porene i den nøytrale gel, som tjener som en stasjonær fase. Den hydrodynamiske diameteren av insulinmonomeren og dimeren er proporsjonal med molekylvekten og er henholdsvis 2,69 og 5,50 nm [115].

I 1967 ble det vist at GE-IHDD-metoden viste at kommersielle preparater av insulin, renset ved krystallisering, inneholder urenheter med en molekylvekt som overskrider molekylvekten av insulin [63]. På kromatogrammet av svineinsulin ble det funnet tre topper, konvensjonelt betegnet som a-, b- og c-komponenter. Siden da har det blitt foreslått en rekke kromatografiske systemer for å kontrollere innholdet av urenheter med høy molekylvekt i insulinpreparater. Separasjonen ble utført på høyt svellende agarose xerogeler (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.). Eller dextran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), 1-3 M oppløsninger av eddiksyre ble brukt som IF [127]. Den høye følsomheten til disse sorbentene for komprimering ved trykk som overskrider matrisens svellingstrykk, gjør disse materialene uegnet til drift i HPLC-modusen.

Bruken av gelekskluderingsvæskekromatografi ved høytrykk (GE HPLC) for insulinanalyse ble først beskrevet i 1980, etter utviklingen av harde makroporøse sorbenter kompatible med vann og motstå høye trykk. I [151] ble separasjonen utført på kolonner Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) under denatureringsbetingelser (kombinasjon av 7 M oppløsning av urea, mineralsyrer og ikke-ioniske vaskemidler). Behovet for insulinanalyse under denatureringsbetingelser er forbundet med insulinets evne til å aggregere i oppløsning. For separasjon av insulin under betingelsene for HPLC HPLC, er bruken av den "tradisjonelle" elueringseddiksyre også blitt beskrevet [152]. Bruk av eddiksyre har flere fordeler - minimal innvirkning på den opprinnelige strukturen av de separerte forbindelser, tilgjengelighet, lave kostnader, i tillegg er et viktig faktum at eddiksyre kan undertrykke assosiasjonen av insulin.

For tiden er HPLC ghvd en farmakopémetode for overvåkning av innholdet av urenheter med høy molekylvekt i stoffer og ferdige doseringsformer. Metoden brukes også til å bestemme innholdet av protamin i isofan-insulinpreparater.

Bruken av HPLC på reverserte faser (RP HPLC) for separasjon av storfe og svininsulin for første gang demonstrerte den høye effektiviteten av denne metoden for analyse av insulinlignende peptider med en lignende struktur.

Mekanismen for separering av proteiner og polypeptider under betingelsene for RP HPLC er basert på den forskjellige hydrofobiciteten av insulinmolekyler og beslektede urenheter. Til dags dato har flere dusinvis av metoder for kromatografisk separasjon av insulin av forskjellig opprinnelse og deres derivater, inkludert proinsulin, pankreas polypeptider, dezamidederivater, insulindimer, blitt beskrevet. [126] viste muligheten for å separere kylling, kanin, sau og hestinsulin. Humant, biff og svinekulinsulin ble også separert. Lloyd og Corran publiserte en metode for separering av biff, svinekjøtt, humane insuliner og deres tilsvarende deamiderte former [104].

Separasjon utføres på silikagel-sorbenter modifiserte, metyl-, butyl-, oktyl-, oktadecyl- og fenylgrupper i isokratisk eller gradientmodus. Som PF brukes organiske modifikatorer - acetonitril, metylalkohol, isopropylalkohol, blandet med vandige bufferløsninger som inneholder uorganiske salter og ion-dampreagenser. Toppdeteksjon utføres hovedsakelig ved spektrofotometrisk metode ved en bølgelengde på 190-220 nm, fluorometriske metoder er også beskrevet [103].

Analysen av stoffet og de ferdige doseringsformene av insulin ved hjelp av RP HPLC er beskrevet i private artikler i den amerikanske og europeiske farmakopé [79,150]. Metoden brukes til å teste medikamenter fra den angitte gruppen når det gjelder "Insulin Authenticity", "Related Proteins", "Quantitative Determination" og "Insulin in Solution".

Forsknings litteraturen beskriver også bruken av ionebytte- og affinitetskromatografi for insulinanalyse [44.102], men disse metodene har ikke blitt mye brukt i farmakopépraksis.

Valget av betingelser for kromatografisk bestemmelse av protamin i doseringsformene av isophan-insulin

En økning i PF-ionstyrken fører vanligvis til økt insulinkapasitetsforhold, noe som kan skyldes en rekke faktorer: - økning av ionekonsentrasjonen reduserer ioniseringsgraden av de ladede gruppene i proteinmolekylet, øker dens hydrofobicitet / - høye konsentrasjon av kationer bidrar til å screene frie silanolgrupper på overflaten en fase som svekker den ikke-spesifikke elektrostatiske samspillet mellom de protonerte aminogruppene i proteinet med matrisen; - Høy ionstyrke påvirker den romlige strukturen av insulin, som et resultat av hvilken overflaten som er tilgjengelig for samspillet med sorbenten endres. Konsentrasjonen av uorganiske salter i FS påvirker formen på toppene og selektiviteten av separasjonen av insulin og desamido-Asn-insulin [143,144]. Med isokratisk eluering på LiChrosorb Сів sorbent med 0,1 M natriumfosfatløsning (pH 2,3) ble det oppnådd et tilfredsstillende resultat bare når natriumsulfat ble tilsatt til bufferoppløsningen til en konsentrasjon på 0,1 M. De fleste insulinanalysemetoder som inngår i farmakopéartikler og ND, bruk PF på basis av bufferløsninger med et natriumsulfatinnhold som er lik 0,2 M. Et slikt høyt innhold av natriumsulfat påvirker negativt reproduksjonsevnen av kromatografisultater på grunn av stratifisering av eluenter, høyt konsentrerte saltløsninger har en negativ effekt på kromatografisk utstyr, forkortet levetiden. Med tanke på at farmakopéanalysemetoder ble utviklet for mer enn 20 år siden, virket det interessant å studere kromatografisk oppførsel av insulin under OF-HPLC på de kromatografiske sorbenter av den nyeste generasjonen, avhengig av konsentrasjonen av natriumsulfat. Samtidig forsøkte de å finne ut om en reduksjon i natriumsulfatinnholdet i PF er tillatt uten en betydelig forverring i separasjonsevnen til kromatografisk system. Som et resultat av forskningen ble det funnet at effekten av natriumsulfatkonsentrasjon i PF er forskjellig, avhengig av typen av graftfasen, samt på typen av insulin. På sorbenter med podede grupper C4 og C Selektiviteten av separasjonen av topper av humant insulin og desamido-Asn-humant insulin er ikke avhengig av natriumsulfatkonsentrasjonen i. buffer1-oppløsning i området fra 0,05 M til 0,2 M. På Diaspher-110-C18-sorbenten har separeringsselektiviteten til dette tospaket maksimalt 0,05 M og et minimum ved 0,1 M (diagram 4). På den annen side avhenger selektiviteten av separasjonen av dyrearter av insulin og deres tilsvarende desamiderte AsnA21-former ikke av ionets styrke av løsningen når den separeres på en Diaspher-110-C18-sorbent. På en sorbent med C8-podede grupper øker selektiviteten fra 1,25 til 1,28 med en økning i natriumsulfatkonsentrasjonen (figur 4). På en sorbent med C4-graftede grupper er separasjonsselektiviteten i tilfelle av biffinsulin maksimalt ved 0,1 M natriumsulfat og minst 0,2 M. For svinekulinsulin er det ingen uttalt maksimum ved en natriumsulfatkonsentrasjon på 0,1 M, i dette tilfellet en økning i ionisk styrker førte til en reduksjon av selektiviteten til separasjon (figur 4). Antall effektive teoretiske plater øker med økende natriumsulfatkonsentrasjon. Unntaket er oppførselen av humant insulin på sorbenten Diasfer-110-C8 (figur 5). Graden av separasjon av topper av insulin og desamido-Asn-insulin øker med en økning i ionstyrken til FS, uavhengig av arten av insulin og graftfasen (figur b). Ved å redusere natriumsulfatkonsentrasjonen fra 0,2 M til 0,1 M, reduseres graden av separasjon av det valgte par toppene i gjennomsnitt med 5% for humane og porøse insuliner og med 10% for biff insulin. Med tanke på at absoluttverdien av graden av separasjon overstiger 2,0, er den målte forverringen i kolonnens separasjonskapasitet, etter vår mening, ikke signifikant. Følgelig kan konsentrasjonen av natriumsulfat i bufferoppløsningen PF reduseres med 2 ganger i sammenligning med farmakopéelle analysemetoder.

I de fleste studier på analysen av proteiner og peptider utføres separasjonen ved romtemperatur. Dessuten indikerer noen forfattere at effekten av temperatur på selektiviteten av separasjon er minimal [48]. Imidlertid, med økende temperatur akselereres prosessen med masseutveksling mellom de stasjonære og mobile faser, noe som fører til en reduksjon i peptidens retensjonstid og innsnevring av toppene.

Insulinteknologi

Brudd på insulinsekresjon. Bruken av affiliate fotografering. Ordning for insulin. Ekspresjon av proinsulin i E. coli-celler. Tilnærminger til å løse problemet med diabetes. Bidraget av bioteknologi til industriell produksjon av ikke-peptidhormoner.

Send ditt gode arbeid i kunnskapsbasen er enkel. Bruk skjemaet nedenfor.

Studenter, studenter, unge forskere som bruker kunnskapsbasen i sine studier og arbeid, vil være veldig takknemlige for deg.

Skrevet på http://www.allbest.ru/

UDDANNELSE OG Vitenskap i republikken KAZAKSTANS

KAZAKH AGRO-TEKNISK UNIVERSITET NAMED AF S.SEYFULLIN

Institutt for mikrobiologi og bioteknologi

På disiplinen "Bioteknologi mokroorganizmov"

Om emnet: Teknologi for insulin

Fullført: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Kontrollert: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

FORKORTELSER OG SYMBOLER

1. Oppdagelseshistorie

2. Få insulin i bioteknologi

3. Måter å få humant insulin

4. Ekspresjon av proinsulin i E. coli-celler

5. Rensing av insulin

6. Dosering og administrasjon

I dette kurset brukte arbeidet følgende definisjoner:

Proteinbærer - tilveiebringelse av transport av hybridproteinet i periplasmatisk rom av cellen eller kulturmediet;

Affinity-komponent - gjør det lettere å velge et hybridprotein.

Insulin (fra det latinske. Insula - øya) - et peptidhormon, dannes i beta-cellene i øyene av Langerhans i bukspyttkjertelen.

Interleukiner er en gruppe cytokiner som er syntetisert hovedsakelig av leukocytter (derfor ble slutt-"-leukin" valgt).

Proinsulin er en forløper for insulin syntetisert av B-cellene i bukspyttkjertelen.

Kromatografi (fra gresk. Chroma, kromatos - farge, maling), fysisk-kjemisk metode for separasjon og analyse av blandinger, basert på fordelingen av komponentene mellom de to faser - stasjonær og mobil (elueringsmiddel) som strømmer gjennom den stasjonære.

Encapsulation - en programmeringsspråksmekanisme som begrenser tilgangen til komponentene som utgjør et objekt (metoder og egenskaper), gjør dem private, det vil si kun tilgjengelig i et objekt.

Et fusjonsprotein (fusjonsprotein, også et kimært sammensatt protein) er et protein oppnådd ved å kombinere to eller flere gener som opprinnelig kodet for separate proteiner.

Hormoner (fra gresk. Hormao - bringe i bevegelse, indusere), hormoner, biologisk aktive substanser produsert av endokrine kjertler eller endokrine kjertler, og utskilles direkte av dem til blodet.

Diabetes mellitus er en gruppe av endokrine sykdommer, som utvikles som følge av absolutt eller relativ mangel på hormoninsulin.

Encapsulation - en programmeringsspråksmekanisme som begrenser tilgangen til komponentene som utgjør et objekt (metoder og egenskaper), gjør dem private, det vil si kun tilgjengelig i et objekt.

Somatostatin er et hormon av deltacellene i bukspyttkjertelen i Langerhans, så vel som et av hormonene i hypothalamus.

Radioimmunanalyse er en metode for kvantitativ bestemmelse av biologisk aktive stoffer (hormoner, enzymer, stoffer, etc.) i biologiske væsker basert på den konkurrerende bindingen av den ønskede stabile og ligner dem radionuklidmerkede stoffer med spesifikke bindingssystemer.

FORKORTELSER OG SYMBOLER

HPLC - High Performance Liquid Chromatography

cDNA - komplementær deoksyribonukleinsyre

Hovedfunksjonen til insulin er å sikre permeabiliteten av cellemembraner for glukosemolekyler. I en forenklet form kan det sies at ikke bare karbohydrater, men også noen næringsstoffer, i siste instans er delt inn i glukose, som brukes til å syntetisere andre karbonholdige molekyler, og er den eneste typen drivstoff for cellulære kraftverk - mitokondrier. Uten insulin faller permeabiliteten til cellemembranen til glukose 20 ganger, og cellene dør av sult, og overskudd av sukker oppløst i blodet forgifter kroppen.

Insuffensjonssymptomer på grunn av beta-celledestinasjon - absolutt insulinmangel - er et sentralt element i patogenesen av type 1 diabetes mellitus. Brudd på effekten av insulin på vev - relativ insulinmangel - har et viktig sted i utviklingen av type 2 diabetes.

Bruken av affinitetskromatografi har signifikant redusert innholdet av forurensende proteiner i preparatet med høyere molekylvekt enn insulin. Slike proteiner inkluderer proinsulin og delvis spaltede proinsuliner, som er i stand til å indusere produksjonen av antiinsulinantistoffer.

Bruken av humant insulin fra begynnelsen av behandlingen minimerer forekomsten av allergiske reaksjoner. Humant insulin absorberes raskere og, uavhengig av stoffets form, har en kortere virkningstid enn animalsk insulin. Humane insuliner er mindre immunogener enn svinekjøtt, spesielt blandet oksekjøtt og svineinsulin.

Formålet med dette kurset arbeidet er å studere insulinens teknologi. For å oppnå følgende mål ble satt:

1. få insulin i bioteknologi

2. Måter å få insulin

H. Insulinrensing

Insulinfunnets historie er knyttet til navnet til den russiske legen I.M. Sobolev (andre halvdel av 1800-tallet), som viste at nivået av sukker i humant blod er regulert av et spesielt hormon i bukspyttkjertelen.

I 1922 ble insulin isolert fra bukspyttkjertelen introdusert til en tiårig gutt for første gang, en diabetespasient overgått alle forventninger, og et år senere løste det amerikanske selskapet Eli Lilly det første dyreinsulinpreparatet.

Etter å ha mottatt den første industrielle sats med insulin de neste årene, har en stor måte å isolere og rense seg på, blitt dekket. Som et resultat ble hormonet tilgjengelig for pasienter med type 1 diabetes.

I 1935 optimaliserte den danske forskeren Hagedorn insulinvirkningen i kroppen ved å foreslå en forlenget medisinering.

De første insulinkrystaller ble oppnådd i 1952, og i 1954 deifiserte den engelske biokjemisten G. Senger de strukturer av insulin. Utviklingen av metoder for rensing av hormonet fra andre hormonelle stoffer og produkter med insulinreduksjon gjorde det mulig å oppnå homogent insulin, kalt enkeltkomponent insulin.

På begynnelsen av 70-tallet. Sovjetiske forskere A. Yudaev og S. Shvachkin foreslo kjemisk syntese av insulin, men implementeringen av denne syntesen i industriell skala var dyr og urentabel.

I fremtiden var det en progressiv forbedring i grad av rensing av insuliner, noe som reduserte problemene som følge av insulinallergier, nedsatt nyrefunksjon, synshemming og immuninsuffisjonsbestandighet. Det mest effektive hormonet var nødvendig for substitusjonsbehandling i diabetes mellitus - homologt insulin, det vil si humant insulin.

På 80-tallet gjorde fremskritt i molekylærbiologi det mulig å syntetisere begge humane insulinkjeder ved bruk av E. coli, som deretter ble kombinert til et biologisk aktivt hormonmolekyl, og rekombinant insulin ble oppnådd ved Institutt for bioorganisk kjemi ved det russiske vitenskapsakademiet ved hjelp av genetisk utviklede E.coli-stammer.

2. Få insulin i bioteknologi

Insulin, et peptidhormon av bukspyttkjerteløyene i Langerhans, er den viktigste behandlingen for diabetes mellitus. Denne sykdommen er forårsaket av mangel på insulin og manifesteres av en økning i blodglukosenivå. Inntil nylig ble insulin oppnådd fra bukspyttkjertelen til en oks og en gris. Legemidlet adskilt fra humant insulin 1-3 aminosyreutskiftninger, slik at det var en trussel om allergiske reaksjoner, spesielt hos barn. Stor terapeutisk bruk av insulin ble begrenset av høye kostnader og begrensede ressurser. Ved kjemisk modifikasjon ble insulin fra dyr gjort uenseligelig fra menneske, men dette medførte en ytterligere økning i kostnaden for produktet. [1]

Siden 1982 har Eli Lilly produsert genetisk utviklet insulin basert på separat syntese av E. colie- og B-kjeder. Kostnaden for produktet er redusert betydelig, det produserte insulin er identisk med mennesket. Siden 1980 har det vært rapporter i pressen om kloning av proinsulin-genet, en forløper for hormonet, som passerer til en moden form med begrenset proteolyse.

Innkapslingsteknologien er også knyttet til behandling av diabetes: bukspyttkjertelceller i en kapsel, introdusert en gang i pasientens kropp, produserer insulin innen ett år.

Integrert genetikk har lansert produksjonen av follikelstimulerende og luteiniserende hormoner. Disse peptidene består av to underenheter. På dagsordenen er spørsmålet om industriell syntese av oligopeptidhormoner i nervesystemet, ankephalin, bygget fra 5 aminosyrerester og endorfiner, morfinanaloger. Med rasjonell bruk av disse peptidene lindrer smerte, skaper et godt humør, øker effektiviteten, konsentrerer oppmerksomheten, forbedrer hukommelsen, sørger for søvn og våkenhet. Et eksempel på den vellykkede anvendelsen av gentekniske metoder er syntesen av p-endorfin ved bruk av hybridproteinteknologien beskrevet ovenfor for et annet peptidhormon, somatostatin [2].

3. Måter å få humant insulin

Historisk sett er den første måten å skaffe insulin til terapeutiske formål, å isolere analoger av dette hormonet fra naturlige kilder (pankreasøyler av storfe og griser). På 20-tallet i forrige århundre ble det funnet at okser og svininsulin (som er nærmest menneskelig insulin i struktur og aminosyresekvens) viser aktivitet i menneskekroppen som er sammenlignbar med humant insulin. Etter dette ble oksin eller svin insulin brukt i lang tid for å behandle pasienter med type 1 diabetes. Imidlertid ble det etter en tid vist at i noen tilfeller begynner antistoffer mot bovin og svineinsulin å samle seg i menneskekroppen og derved nullere effekten.

På den annen side er en av fordelene med denne metoden for å skaffe insulin råstofftilgjengelighet (oksin og svin insulin kan lett oppnås i store mengder) som spilte en avgjørende rolle i utviklingen av den første metoden for å oppnå humaninsulin. Denne metoden kalles semisyntetisk [3].

I denne metoden for å produsere humant insulin ble porcin insulin brukt som et råmateriale. Renset porcin insulin ble spaltet av det C-terminale oktapeptidet av B-kjeden, hvorpå det C-terminale oktapeptid av humant insulin ble syntetisert. Deretter ble det kjemisk festet, beskyttelsesgruppene ble fjernet og det oppnådde insulin ble renset. Ved testing av denne metoden for å skaffe insulin ble den totale identiteten til hormonet oppnådd for humant insulin blitt vist. Den største ulempen ved denne metoden er den høye kostnaden av det resulterende insulin (selv nå er kjemisk syntese av oktapeptid dyrt, spesielt i industriell skala).

For tiden er humant insulin hovedsakelig oppnådd på to måter: ved å modifisere svinekulinsulin ved en syntetisk-enzymatisk metode og ved en genteknisk metode.

I det første tilfellet er metoden basert på det faktum at porcin insulin er forskjellig fra humant insulin ved en enkelt substitusjon ved C-terminalen til Ala30Thr B-kjeden. Utskifting av alanin med treonin utføres ved enzymkatalysert spaltning av alanin, og i stedet fester en karboksylbeskyttet treoninrest tilstede i reaksjonsblandingen i et stort overskudd. Etter spaltning av den beskyttende O-tert-butylgruppe oppnås human insulin. (bilde 1)

Figur 1 - Diagram over metoder for fremstilling av humant insulin

Insulin var det første proteinet oppnådd for kommersielle formål ved bruk av rekombinant DNA-teknologi. Det er to hovedmetoder for å skaffe seg genetisk utviklet humant insulin. I det første tilfellet produserer separate (forskjellige produsentstammer) begge kjedene etterfulgt av foldingen av molekylet (dannelsen av disulfidbroer) og separasjonen av misoformen. I det andre preparatet i form av en forløper (proinsulin) etterfulgt av enzymatisk spaltning med trypsin og karboksypteptase. Til den aktive formen av hormonet. Den mest foretrukne for tiden er produksjonen av insulin som en forløper, som sikrer korrekt lukning av disulfidbroer (i tilfelle av separat produksjon av kjeder, påfølgende sykluser av denaturering, separering av misoformen og renaturering utføres [3].

I begge tilnærminger er det mulig både individuelt å oppnå startkomponentene (A- og B-kjeder eller proinsulin), og som en del av hybridproteiner. I tillegg til A- og B-kjeder eller proinsulin kan det være tilstede i sammensetningen av hybridproteiner:

1) bærerprotein - sikrer transport av hybridproteinet inn i periplasmatisk rom av cellen eller dyrkingsmediet;

2) Affinitetskomponent - gjør det lettere å velge et hybridprotein.

Samtidig kan begge disse komponentene samtidig forekomme i sammensetningen av hybridproteinet. I tillegg kan prinsippet om multidimensionalitet brukes ved dannelse av hybridproteiner (det vil si at flere kopier av målpolypeptidet er tilstede i hybridproteinet), som gjør det mulig å øke utbyttet av målproduktet betydelig [4].

Vi brukte JM 109 N1864-stammen med en nukleotidsekvens innebygd i et plasmid som uttrykker et hybridprotein, som består av lineært proinsulin og et fragment av Astaphylococcusaureus-proteinfragment festet til dets N-terminus gjennom en metioninrest. Dyrking av mettet biomasse av celler i den rekombinante stammen sikrer starten på produksjonen av hybridproteinet, hvor isoleringen og sekvensiell transformasjon av intuisen fører til insulin. En annen gruppe forskere mottok i bakterieekspresjonssystemet et fusjonsrekombinant protein bestående av humant proinsulin og en polyhistidinhale festet til den via en metioninrest. Den ble isolert ved anvendelse av chelatkromatografi på Ni-agarosekolonner fra inklusjonslegemer og ble fordøyd med cyanogenbromid. Forfatterne fastslått at det isolerte protein er S-sulfurisert. Kartlegging og massespektrometrianalyse av det oppnådde proinsulin, renset ved ionebytekromatografi på anionbytter og RP (revers fase) HPLC (høyytelsesvæskekromatografi) viste nærvær av disulfidbroer som tilsvarer disulfidbroer av nativt humant proinsulin. Det rapporterte også om utvikling av en ny, forbedret metode for å skaffe humaninsulin ved genetiske prosesser i prokaryote celler. Forfatterne fant at insulinet som er oppnådd i sin struktur og biologiske aktivitet, er identisk med hormonet isolert fra bukspyttkjertelen [5].

Nylig er det lagt stor vekt på å forenkle prosedyren for å produsere rekombinant insulin ved gentekniske metoder. Således ble et fusjonsprotein bestående av et ledepeptid av interleukin festet til N-terminalen av proinsulin oppnådd via en lysinrest. Proteinet ble effektivt uttrykt og lokalisert i inkluderingslegemer. Etter isolering ble proteinet spaltet med trypsin for å produsere insulin og C-peptid. En annen gruppe forskere handlet på lignende måte. Fusjonsproteinet som består av proinsulin og to syntetiske domener av Staphylococcus protein A, som binder IgG, var lokalisert i inklusjonslegemer, men hadde et høyere uttrykksnivå. Proteinet ble isolert ved affinitetskromatografi ved bruk av IgG og behandlet med trypsin og karbokypeptidase B. Det resulterende insulin og C-peptid ble renset ved RP-HPLC. Når man oppretter fusjonsstrukturer, er masseforholdet mellom bærerproteinet og målpolypeptidet meget signifikant. Slik beskrives utformingen av fusjonskonstruksjoner, hvor et protein som binder humant serumalbumin ble brukt som bærerpolypeptid. En, tre og syv C-peptider ble festet til den. C-peptider ble kombinert på halehale-basis ved bruk av aminosyreavstandsstykker som bærer Sfi I-restriksjonsstedet og to argininrester i begynnelsen og på slutten av avstandsstoffet for etterfølgende spaltning av proteinet med trypsin. HPLC-spaltningsprodukter viste at C-peptid spaltes kvantitativt, og dette tillater bruk av metoden for multimere syntetiske gener for å produsere målpolypeptider i industriell skala.

Oppnå mutant proinsulin, som inneholdt erstatning av Arg32Tyr. Med den felles spaltning av dette proteinet med trypsin og karboksypteptase B ble naturlig insulin og C-peptid inneholdende en tyrosinrest dannet. Sistnevnte, etter 125I-merking, brukes aktivt i radioimmunoassay [6].

Insulin Quality Control

Innholdet

1. Generell informasjon om hvordan du får insulin 5

2. Metoder som brukes til å kontrollere insulinets kvalitet 8

Referanser 17

Utdrag fra arbeid

1-2% av den europeiske befolkningen lider av diabetes, og ca 20% av pasientene kan ikke eksistere uten insulininjeksjoner. Siden de første forsøkene på bruk av insulin til behandling av diabetes i 1922, ble dette hormonet isolert fra bukspyttkjertelen hos dyr (kyr og griser). Animal insulin er litt forskjellig i aminosyresekvens fra human insulin.

Menneske- og grisinsulinene er spesielt nært: i grisinsulin erstattes den C-terminale treonin av B-kjeden med alanin. Koe og humant insulin er forskjellig i tre aminosyrerester. Det var disse forskjellene som bestemte den økte immunogene aktiviteten til bovint insulin sammenlignet med grisinsulin.

Nesten alle pasienter som ble behandlet med kuinsulin hadde antistoffer mot insulin i blodet. De antigene egenskapene til insulin ble også delvis bestemt av urenheter i preparatene. Mest sannsynlig var det dannelsen av antistoffer mot insulin som forklarte noen mindre bivirkninger ved injeksjon av koinsulin, for eksempel atrofi av subkutant fett på gjeninjektjonsstedet. I tilfelle av sterkt renset insulin var disse effektene fraværende.

Etterpå, takket være genteknologi og bruk av E. Coli, ble human insulin oppnådd.

Humant insulin, oppnådd av E. coli, var det første "genetisk konstruerte" proteinet testet hos mennesker. I eksperimenter med friske frivillige ble det funnet at det er trygt (ikke forårsaker allergiske og andre uønskede reaksjoner) og har evnen til å redusere nivået av glukose i blodet når det administreres under huden eller intravenøst.

For tiden er slik menneskelig insulin oppnådd av mange diabetikere over hele verden. Dette ble foretatt av kliniske studier hvor metabolske endringer og immunologiske effekter ble studert.

Relevansen av vårt emne er at ukontrollert eller dårlig kontrollert produksjon kan føre til utslipp av forurenset insulinpreparater, noe som igjen kan føre til negative kliniske konsekvenser.

Hensikten med dette arbeidet er å studere metodene som brukes i kvalitetskontrollen av insulin.

referanser

GOST R 52249-2004 "Regler for produksjon og kvalitetskontroll av legemidler" 2004

OFS 42-0002-00 "Bakterielle endotoksiner" 2000

OFS 42-0126-09 "Biologisk testing av insulin"

Farmakopé artikkel av Russland FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Geneteknikk av humant insulin: suksesser og prospekter // Russisk kjemisk tidsskrift. - 2005. - T. XLIX. - № 1. - s. 34-45.

Goncharenko G.G. Grunnleggende om bioteknologi: Undervisningsmetode. kompleks for stud.biolog. spec. / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min. arr. RB. - Gomel: EI "GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 s.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Anvendelse av den kinetisk-kromogene metoden for bestemmelse av bakteriell endotoksin (LAL-test) i rensingsteknologien for genetisk utviklet humaninsulin // Biopharmaceutical journal - 2009. - Vol. 1. - №1. - s. 34-37.