Bestemmelse av glukose ved glukoseoksydasemetoden

Analyser

Å bestemme konsentrasjonen av glukose i blodet er en av de mest utførte biokjemiske studier i laboratorier.

Glukoseoksidase metode for bestemmelse av glukose i blod og urin Basert på glukoseoksidasjon reaksjonen i nærvær av enzymet glukose oksidase til dannelse av hydrogenperoksyd, som i sin tur i nærvær av peroksidase for oksyderes ortotolidin for å danne farvede produkter; o Konsentrasjonen av glukose er lovet av mengden fargede produkter.

Siden glukoseoksidasemetoden er rettet mot å identifisere glukose, og ikke alle typer sukkerarter, brukes den i differensialdiagnosen av følgende sykdommer:

Prinsippet for glukoseoksidasemetoden for bestemmelse av glukose

Glukose i nærvær av enzymet glukoseoksidase oksyderes ved atmosfærisk oksygen for å danne hydrogenperoksid under reaksjonen. Hydrogenperoksid i nærvær av peroksidaseenzym oksiderer ortotoluidin for å danne en farget forbindelse, hvis fargestyrke er proporsjonal med glukoseinnholdet. Denne metoden lar deg bestemme nivået av glukose i blodplasma, serum og cerebrospinalvæske.

Normal blodglukose, mmol / l

- i plasma, i natsheartse

nyfødte - 1,7 - 4,2
barn fra 6 uker til 15 år - 3,3 - 5,4
voksne (menn, kvinner) - 3,9 - 5,6

- i serum, i natsheart

nyfødte - 2,6 - 4,2
barn fra 6 uker til 2 år - 3,3 - 5,4
voksne (menn, kvinner) - 3,9 - 5,6

Nødvendige reagenser for glukosebestemmelse ved glukoseoksidasemetoden

1. Natriumklorid 9 gram / liter (isotonisk løsning): Fremstilt ved å oppløse 0,9 g NaCl i 100 ml vann.

2. Sinksulfat, 50 g / l: 5 g sinksulfat (ZnSO4) oppløses i vann, volumet bringes til 100 ml.

3. Natriumhydroksid, 0,3 mol / l: Fremstilt ved å oppløse 1,2 g NaOH i 100 ml vann, konsentrasjonen kontrolleres ved titrering (den skal være 0,3 n).

4. Ortotoluidin, 1% løsning: 1 g av legemidlet er oppløst i 100 ml absolutt alkohol. Løsningen kan oppbevares i kjøleskap i en flaske med en glasspropp i flere måneder. Et kommersielt tilgjengelig produkt kan renses ved omkrystallisering, for hvilket det er oppløst i absolutt alkohol, vann tilsettes og de utfelte krystaller suges av på et filter og tørkes deretter over kalsiumklorid.

5. Acetatbuffer pH 4,8: Bland 4 deler av 0,25 N eddiksyre (sjekk titrering) og 6 deler 0,25 N natriumacetat (inneholdende 34 g av CH3COONa X ZN2O i 1 liter).

6. Glukoseoksidase er et tørt preparat med en aktivitet på 3000 enheter / mg eller mer.

7. Pepperrotperoksidase. 1 mg oppløses i 5 ml acetatbuffer, den kan lagres i kjøleskapet i flere dager.

8. Arbeids reagens: 80 ml acetatbuffer ble oppløst 2 mg glukose oksydase og 1 mg peroksidase, ble det tilsatt 1 ml av 1% ortotoluidina oppløsning, omrørt og volumet ble justert med buffer til 100 ml. Arbeidet reagens må være gjennomsiktig, fargeløs eller har en svak grønn fargetone, i så fall er den stabil når den oppbevares i kulde. Hvis fargen er intens eller etter et par timer etter forberedelsen begynner et bunnfall å falle, det betyr at orthotoluidin ikke er rent nok og må omkrystalliseres.

9. Kalibrer glukoseløsninger. Glukose fortørkes ved 37 ° C og lagres i en ekssikator. Først utarbeide en grunnleggende løsning med en konsentrasjon på 50 mmol / l, hvorav 180 mg av stoffet er oppløst i 20 ml mettet oppløsning (ca. 0,3%) benzoesyre. Fra denne løsningen skal du forberede arbeidskalibreringsløsninger som inneholder 3; 6; 9; 12; 15; 18 og 21 mmol / l, for hvilke de tar 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 og 4,2 ml av basisoppløsningen og bring den mettede løsningen av benzosyre til et volum på 10 ml. Disse løsningene inneholder glukose i samme konsentrasjoner som det forekommer i blodet, noe som letter beregninger under kalibrering.

Fremgang av glukosebestemmelse ved glukoseoksidasemetoden

I sentrifugeringsrørene tilsettes 1,1 ml natriumkloridoppløsning, 0,4 ml sinksulfatoppløsning og 0,4 ml 0,3 n NaOH-løsning, blandes; Samtidig dannes en meget tynn sinkhydroksydgel, 0,1 ml blod eller kalibreringsoppløsning frigjøres i den, blandes igjen og sentrifugeres etter 10 minutter ved en hastighet på 3000 rpm i 10 minutter.

Til 1 ml supernatant tilsett 3 ml arbeidsreagens og bland forsiktig.

En farge begynner gradvis å utvikle, som ved en vanlig romtemperatur når et maksimum på 13-15 minutter, og deretter gradvis reduseres. Fotometrisk alltid etter samme tidsperiode etter å ha tilsatt arbeidsreagenset i kyvetter med en optisk vei lengde på 1 centimeter med et rødt lysfilter (bølgelengde 625 nm) mot tomgang, som settes samtidig med arbeidsprøvene, men i stedet for blod, ta fysiologisk natriumkloridløsning.

Ved utarbeidelse av kalibreringsgrafen blir 0,1 ml av riktig kalibreringsløsning tatt i stedet for blodprøver.

Beregning av glukose kan utføres i henhold til proporsjonsreglene eller kalibreringsskjemaet, for å bygge som konsentrasjonen av glukose (mmol / l) legges på en akse, og utryddelsesverdien er på den andre.

Merknader om glukosebestemmelsesmetode ved glukoseoksidasemetode

1. Du kan først slippe blodet fra pipetten til en isotonisk løsning av natriumklorid, og deretter legge til løsninger av sinksulfat og NaOH.

2. Når systematisk arbeid er ikke nødvendig å kontinuerlig bygge opp en kalibreringskurve ved alle punkter, er det nok til å håndtere blindprøve daglig og 2-3 punkter i området 3-9 mmol / l, og det hele kalibreringskurven bygge opp bare ved endring av reagensene eller smi-teknikker.

Glukoseoksidasemetode for bestemmelse av glukose

Glukosoksidasemetoden brukes til å bestemme konsentrasjonen av glukose utelukkende i forskjellige kroppsvæsker. Fordelen med denne testen er dens nøyaktighet. Diagnostikk, i motsetning til raske metoder, gjør det mulig å avsløre mengden ren glukose uten fruktose og andre sukkerarter. Prinsippet for denne reaksjonen er å fargeløsningen, som oppstår som et resultat av samspillet mellom oksydasjonsmidler med spesifikke fargestoffer. Evaluering av forskningsresultater utføres ved bruk av metoden for kolorimetri og sammenligning med standardløsninger.

Når er glukoseoksidasemetoden foreskrevet?

Denne testen brukes til å oppdage nedsatt sukkertoleranse og utviklingen av pre-diabetes, samt på høyden av sykdommen. Men analyse er sjelden brukt til slike formål, dette skyldes høye kostnader og lang ventetid på resultatet. Oftest er bestemmelsen av glukose i blodet og urinen ved hjelp av denne metoden brukt i differensialdiagnosen av sykdommer som:

laktoseintolerans syndrom;
fruktoseintoleranse;
frigjøring av fruktose med kroppsvæsker;
økt konsentrasjon av pentose i urinen.

Den utvilsomt fordel ved glukoseoksidasetest er dens nøyaktighet.

Hva er grunnlaget for denne metoden?

Det finnes ulike metoder for å bestemme konsentrasjonen av glukose i blodet, men glukoseoksidase er den mest nøyaktige. Bunnlinjen er at samspillet mellom sukker og oksygen i luften oksiderer reagenset. Hydrogenperoksid slippes ut i løsningen. Dette stoffet interagerer med ortotoluidin, danner en farget forbindelse. For oppførselen til denne reaksjonen krever tilstedeværelse av spesielle enzymer. Glukoseoksidase må være tilstede i oksidasjonsreaksjonen og peroksidase i fargingen av væsken. Intensiteten av fargen på løsningen vil avhenge av glukoseinnholdet og være mest intens med sitt høye innhold.

Essensen av glukoseoksidasemetoden for å bestemme glukose

Evaluering av resultatet skjer ved bruk av den kvantitative metoden for fotometri i samme tidsintervall. Sørg for å bruke en kalibreringsløsning som inneholder en bestemt angitt sukkerrate, og fra det kan du dømme konsentrasjonen av glukose i kroppsvæskene, ofte i blodet.

Hvordan er analysen gjort?

Materialet tas fra pasienten på tom mage. For testen ved bruk av venøst blod i en mengde på 5 ml. På dagen før diagnosen viser pasienten en streng diett. Dette vil tillate å dømme påliteligheten av resultatet og utelukke mulige feil i analysen. 2 dager før uttak av blod må pasienten gi opp de dårlige vanene med å drikke og røyke. Det er også nødvendig å begrense inntaket av altfor søte retter og, om mulig, unngå stressende situasjoner.

Denne metoden for å bestemme konsentrasjonen av glukose utføres oftest ved hjelp av sentrifugeringsmetoden, som brukes til å separere de formede elementene. Mengden sukker bestemmes i plasma. Når alle nødvendige reagensene blir tilsatt, blir fargen observert etter 20 minutter hvis testen utføres ved romtemperatur. Beregning av glukosenivå utføres i henhold til kalibreringsskjemaet eller ved bruk av delregelen.

Reagenser for forskning

For å bestemme sukker er det mest hensiktsmessig å bruke raske metoder for bestemmelse av glukose i blodet. Dette skyldes brukervennlighet og raske resultater. I tillegg trenger pasienten ikke å gå til laboratoriet eller sykehuset. Men i motsetning til glukoseoksidasetesten er en slik diagnose upålitelig. Siden det ikke skiller glukose fra andre sukkerarter og bestemmer konsentrasjonen sammen.

Grunnlaget for glukoseoksidasereaksjonen er natriumklorid 9% løsning og sinksulfat 50%. De legges til på scenen av blodscentrifugering. I tillegg bruker du en bufferløsning med eddiksyre og natriumacetat. Titreringsmetoden bestemmer dens pH ved 4,8. Deretter tilsettes glukoseoksydase, som forårsaker hydrogenperoksid og peroksidase, som er involvert i å fargelegge oppløsningen til ønsket konsentrasjon for å oppnå et nøyaktig resultat.

Standarder under analyse

Mengden sukker måles i spesielle enheter - millimol per liter løsning.

Blodprøver av glukoseoksidase må utføres på tom mage, og plasma eller serum brukes til dette. Antallet for voksne for både kvinner og menn er 3,3-5,5. For barn under 15 år er denne tallet litt lavere og varierer mellom 3,2 og 5,3. Hos nyfødte er blodsukker 1,7-4,2. Økningen i ytelse observeres med utvikling av en pasient med diabetes mellitus eller i strid med glukosetoleranse. Denne tilstanden er en prediabetes, og hvis den ikke behandles i tide, så vil det snart føre til utvikling av denne alvorlige patologien.

Arbeidsnummer 1. KVANTITATIV BESTEMMELSE AV GLUKOSE I BLODEN. ENZYMATISK (GLUCOSOOXIDAL) METODE

RATIONALE FOR YTELSE AV ARBEID. Bestemmelse av glukose i helblod eller plasma utføres hos hver pasient for å vurdere tilstanden av karbohydratmetabolismen og diagnostisere patologi (hyperglykemi, hypoglykemi). En enzymatisk metode basert på oksydasjon av glukose av glukoseoksidase til glukonsyre i nærvær av oksygen, brukes til å bestemme blodsukkernivået. Metoden er svært spesifikk for bestemmelse av D-glukose i nærvær av andre reduserende stoffer inneholdt i vevekstrakter og biologiske væsker.

METODENS PRINSIPP. Glukosoksidase er et komplekst enzym som inneholder FAD som en protesgruppe. Når glukose oksyderes av glukoseoksydase, skilles to hydrogenatomer fra det første karbonatomet i glukosemolekylet. Videre overføres disse to hydrogenatomene til FAD, FADH dannes₂. Sistnevnte overfører hydrogenatomer til molekylært oksygen for å danne H₂Oh₂. Så H₂Oh₂ den spaltes av peroksidase enzym i vann og atom oksygen, som oksiderer kromogenet (fargestoffet) som blir farget under oksidasjon.

Glukosoksidasemetode

I dag er metoder basert på bruk av enzymet glukoseoksidase mest brukt. Metoden er basert på følgende reaksjon:

Glukoseoksidase katalyserer overføringen av to hydrogenatomer fra det første karbonatomet av glukose til oksygen oppløst i et flytende reagens. I løpet av reaksjonen dannes hydrogenperoksid i ekvimolære mengder. dvs. konsentrasjonen av hydrogenperoksid dannet er nøyaktig lik den målte konsentrasjon av glukose. Følgelig er anvendelse av glukose oksidase reaksjonen, transformert oppgave for bestemmelse av konsentrasjonen av glukose i oppgaven med å bestemme konsentrasjonen av hydrogenperoksid, som, som det vil bli vist nedenfor, er mye enklere først. Og her er det flere metoder som er mye brukt i dag i laboratoriepraksis (se diagram).

Blant de ovennevnte registreringsmetoder mest fotometrisk biokjemisk metode i hvilken molekyler av hydrogenperoksyd ved hjelp av enzymet peroksidase er spaltet for å danne en aktiv form for oksygen - superoksid anion radikal - O₂ -, som igjen oksyderer kromogenet, noe som fører til en signifikant endring i absorpsjonsspekteret av kromogenet.

Den høye populariteten til denne metoden for å bestemme glukose skyldes høy spesifisitet og enkel implementering. Metoden kan implementeres ved bruk av et konvensjonelt fotometer, samt ved bruk av automatiske biokjemiske autoanalysatorer.

Glukosoksidasemetoden er gjenkjent i dag som en av de mest nøyaktige kvantitative metoder for bestemmelse av glukose. Som et biologisk materiale brukes som serum og helblod. Når man arbeider med det sistnevnte bør ta hensyn til det faktum at fangst av andelen av kapillære blodserum (plasma) avhenger av hematokrit, som kan ha en uheldig innvirkning på nøyaktigheten av resultatet. Når man bestemmer glukosen ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor, er det derfor foretrukket å bruke pasientens serum.

Sammen med endpointfotometrisk metode, for flere år siden, oppstod kits der den kinetiske fotometriske metoden ble implementert. Fremgangsmåten består i det faktum at i et visst forhold av glukoseoksydase og peroksydase-aktivitet, vil hastigheten for dannelse av farvede forbindelser for noen tid etter tilsetningen av prøven til arbeidsoppløsningen være proporsjonal med glukosekonsentrasjonen i prøven. Fordelen med denne metoden er at resultatet ikke er avhengig av nærværet av andre forbindelser i prøven, fordi absorpsjonen av den sistnevnte er stabile i tid. Denne metoden krever bruk av et kinetisk fotometer, halvautomatiske analysatorer eller automatiske biokjemiske analysatorer. Måling av glukosekonsentrasjon av fullblod kan hensiktsmessig utføres ved hjelp av anordninger, som er basert på amperometrisk måleprinsipp, ved hjelp av spesielle enzym sensorer. Hydrogenperoksid er en ekstremt ustabil kjemisk forbindelse, og den kan tjene som kilde til ladede partikler. Dette er det som brukes i enzym sensorer av membrantypen eller i de elektrokjemiske elementene av bærbare glukometre.

Til slutt bør vi nevne ulempene ved glukoseoksidasemetoden. Den resulterende hydrogenperoksid og superoksid radikal anion ikke bare kan oksidere kromogenet, men andre stoffer som er tilstede i en biologisk væske: askorbinsyre, urinsyre, bilirubin. I dette tilfellet, tilsvarende, den andel av peroksydet, tar del i oksydasjonen av et kromogen er redusert, noe som fører til en underestimering av glukose resultat. Denne metoden er lineær, opp til 20-30 mmol / l glukose.

Kvantitativ bestemmelse av blodglukose ved glukoseoksydasemetoden

Prinsippet av metoden. Metoden er basert på spesifisiteten av virkningen av enzymet glukoseoksidase. Dette enzymet oksyderer glukose i nærvær av molekylært oksygen for å danne glukonolakton, som spontant hydrolyserer til glukonsyre. Glukoseoksidase oksyderer glukose for å danne hydrogenperoksid (H₂Oh₂), som under virkningen av peroksidase reagerer med 4-aminoantipyrin og fenol. Resultatet er en rosa-farget forbindelse, den optiske densiteten av den ved 510 nm er proporsjonal med konsentrasjonen av glukose i prøven.

2 N₂Oh₂ + 4-aminoantipyrin + fenol → kinonimin + 4H₂Oh

utstyr: KFK, sentrifuge, termostat, stativ, reagensrør, pipetter, biologisk materiale, reagenser inneholdt i arbeidsløsningen.

testprøve, ml

standard prøve, ml

enkel test (N₂O), ml

Kalibreringsglukoseoppløsning (standard)

Rørene ble inkubert i en termostat ved 37 ° C i 15 minutter, deretter UFC kolorimetriruyut på i det grønne lyset filter i celler med en sjikttykkelse på 5 mm mot emnet (H₂O). Rosa farge er stabil i 1 time etter inkubering.

beregningen glukoseinnhold produsert av formelen:

C = x C standard, hvor

C er glukoseinnholdet i forsøksprøven, mol / l;

Eop er den optiske tettheten av prøven;

Est er den optiske tettheten til kalibreringsprøven;

С standard - innhold i kalibreringsløsning, mol / l.

Normale verdier:  nyfødte - 2,8-4,4 mmol / l

 barn - 3,9 -5,8 mmol / l

 voksne - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hypoglykemi (HGH). Økningen i blodsukker skyldes mange årsaker, ifølge hvilke det er to grupper av hyperglykemi.

1. Insulær - assosiert med utilstrekkelig innhold i kroppen av insulin eller på grunn av ineffektiviteten av sin virkning.

2. Ekstrainsulær (ekstrainsulær) - ikke avhengig av effekten av insulin.

Følgende prosesser er mest signifikante ved dannelsen av HGH: forbedret glykogen nedbrytning; økt neoglukogenese; inhibering av glykogensyntese; reduksjon i glukoseutnyttelse av vev under påvirkning av insulin hormon-antagonister: veksthormon, glukokortikoider, thyroxin, thyrotropin.

Alimentary hyperglycemia er kjent med en overdreven tilførsel av glukose i blodet (for eksempel hyperglykemi under sukkerbelastning). "Hepatisk" hyperglykemi forekommer i diffuse lesjoner i leveren.

Vedvarende og alvorlig hyperglykemi følger ofte diabetes mellitus. Akseptert tilveiebringe insulinavhengig diabetes mellitus og insulinavhengig diabetes mellitus, eller, henholdsvis, diabetes type I og type II diabetes. Dannelsen av diabetes mellitus type I er hovedsakelig assosiert med nedsatt syntese og utveksling av insulin.

Den andre gruppen av hyperglykemi forbundet primært med hyperaktivitet av endokrine kjertler, som produserer hormoner - insulin-antagonister. Det er observert i sykdommer slik som syndrom og Cushings sykdom, akromegali, hypertyroidisme, pheochromocytoma, glyukoganoma. Blodglukosenivåene økt, og i visse leversykdommer (særlig 10 til 30% av pasienter med cirrhose i leveren), hemokromatose (pigment cirrhose, bronse diabetes).

Hypoglykemi (HGP) - reduksjon i blodsukker - oftest assosiert med en absolutt eller relativ økning i insulinnivå i blodet. Vnepankreaticheskim hypoglykemi ble observert som et resultat av en ubalanse mellom graden prosesser av glykogenolyse og glukoneogenese i leveren i løpet av akutt og kronisk hepatitt, cirrhose, akutt og subakutt leversykdom, alkoholforgiftning, forgiftning med arsen, fosfor, under langvarig mekanisk gulsott, kongestiv lever, primær eller metastatisk leverkreft. Senker blodglukosekonsentrasjoner er ofte observeres hos pasienter med spiserørskreft og andre ondartede svulster vnepankreaticheskim lokalisering (fibroma, fibrosarkom, neurom), så vel som ukontrollerbar oppkast, anoreksi, hepatisk diabetes, uremi, rikelig laktasjon og glykosuri hos gravide kvinner.

Hypoglykemi kan være av sentral opprinnelse på grunn av mentalt traume, encefalitt, subaraknoid blødning, hjernesvulst.

1. Arvelige forstyrrelser av karbohydrat fordøyelse.

2. Hvilke typer hyperglukose er kjent for deg?

3. Hva er årsakene til patologisk hyperglukosemi?

4. Hva er årsaken til insulinavhengig diabetes mellitus?

5. Hva er de biokjemiske årsakene til arvelige sykdommer: a) glykogenose? b) aglykogenose? c) fruktosemi? d) galaktosemi?

6. Hva er de biokjemiske endringene i karbohydratmetabolismen under fasting?

7. Prinsippet for metoden for å bestemme glukosetoleranse.

Glukoseoksidase- og heksokinase-metoder for bestemmelse av serumglukose i blodet

Nøyaktig diagnose, foreskrivende behandling krever en rekke laboratorietester.

Metoden for å bestemme serumglukose er det viktigste verktøyet for påvisning av hyper- og hypoglykemi hos pasienter med diabetes mellitus.

Metoden gjør det mulig å justere metabolismen av medisinsk terapi. Diagnostiske glukosenivåer kan også bestemmes i helblod og dets plasma.

Metoder for bestemmelse av blodsukker

Metoder for å bestemme mengden glukose i blodet utviklet seg mye.

Noen av dem (reduksjonsmetrisk, kolorimetrisk) blir praktisk talt ikke brukt på grunn av den høye toksisiteten og lave nøyaktigheten av resultatene.

De mest brukte enzymstudiene. Glukosoksidasemetoden er en metode for fargereaksjon som oppstår når karbohydrater oppvarmes. Hexokinase bestemmer blodets aktivitet på heksokinase.

Glukosoksidasemetode

Glukosoksidasemetoden for å bestemme blodglukose er basert på oksidasjonsreaksjonen under påvirkning av et enzym. Dette danner hydrogenperoksid, det flekker stoffet Chromogen, hvor konsentrasjonen bestemmer mengden glukose.

Glukosoksidasemetoden brukes til:

arvelig fruktoseintoleranse;
pentosuria;
laktuloseintoleranse.

Ulempen med studien er at hydrogenperoksid er i stand til å oksidere både kromogen- og askorbinsyre, urinsyre og bilirubin tilstede i blodet. Beregn mengden av glukosefotometrisk metode, intensiteten av flekker sammenlignes med kalibreringsgrafen.

Under laboratorieforhold kan nivået av et stoff bestemmes:

i venøst blod. Automatiske analysatorer brukes;
i kapillærblod. Gjerdet er utført fra en finger.

Den elektrokjemiske metoden består av bruk av elektroder som inneholder glukoseoksidase. Mengden generert hydrogenperoksid, eller det gjenværende nivået av oksygen som forbrukes under oksidasjonsprosessen, bestemmes.

Hexokinase metode

Stoffet er det viktigste enzymet av glukosemetabolismen, noe som begrenser prosessens hastighet i celler.

Under laboratoriebetingelser, under virkningen av heksokinas, blir glukose fosforylert av adenosintrifosfat.

Som et resultat av reaksjonen dannes organiske molekyler, hvorav mengden bestemmes av nivået av lysabsorpsjon i den ultraviolette sone. For rask positiv heksokinasereaksjon kan også være et tegn på forekomsten av ondartede svulster.

Forberedelse for analyse

Blods serumglukosetest er foreskrevet for:

Før analysen må du følge en rekke forhold slik at resultatene er så pålitelige som mulig:

Forskning utføres på tom mage. Materialet tatt om morgenen;
et par dager før diagnosen er det nødvendig å unngå tung fysisk anstrengelse, stress;
I daglig diett skal pasienten ha minst 150 gram karbohydrater. Med en mangel vil nivået av glukose øke, og det faller sakte, noe som forvrenger dataanalysen;
dagen før diagnosen kan ikke røyke og drikke alkoholholdige drikker;
Det er umulig å gjennomføre en undersøkelse etter tung operasjon, fødsel, i nærvær av betennelse. Kontraindisert i analysen av levercirrhose, forverring av sykdommer i mage, tumorprosesser;
et par dager før studien, bør man ikke gjennomgå fysioterapeutiske prosedyrer, ta orale prevensiver, vanndrivende legemidler, psykotrope stoffer, koffein.

Analysen kan gi et falskt positivt resultat i hypokalemi og endokrine sykdommer (Cushing syndrom, tyrotoksikose).

Normer for glukose i blodserum etter alder

Normale indikatorer avhenger av alder:

ledningsblod kan inneholde fra 2,5 til 5,3 mmol / l;
hos premature babyer - fra 1,1 til 3 mmol / l;
barn på den første dagen i livet - fra 2,22 til 3,33;
i en alder av 2,7 til 4,4;
hos barn over 6 år - fra 3,3 til 5,5 mmol / l;
hos voksne opptil 60 år - fra 4,4 til 6,3;
hos eldre - fra 4,6 til 6,1 mmol / l.

Hypoglykemi hos voksne er diagnostisert med glukoseverdier mindre enn 3,3 mmol / l og hyperglykemi - mer enn 6,1 mmol / l.

Glukosoksidasemetode for bestemmelse av glukose i plasma

Vi er glade for å ønske deg velkommen på nettstedet www.unimedao.ru!

Takk for at du svarer på spørsmålet vårt.

19.11.2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

Fra arkivet i avisen "News A / O Unimed"

Bestemmelse av glukosekonsentrasjon i blodet er en av de mest utførte biokjemiske studier i QDL. Årsaken til eksepsjonell popularitet av testen er forbundet med en høy forekomst av diabetes. Denne testen utføres både i ambulante og ambulante klinikker. Pasienter med diabetes er tvunget til å undersøke nivået av glukose i blodet hjemme, fordi uten denne informasjonen er det vanskelig for dem å justere deres diett, mosjon, bruk av insulin og andre antidiabetika. Den eksepsjonelle betydningen av testen og de store volumene av utført forskning har stimulert utviklere til å lage ulike typer enheter og metoder for å bestemme konsentrasjonen av glukose i blodet.

For tiden er det mange metoder for å bestemme glukose. De kan klassifiseres som følger.

Metoder for bestemmelse av glukose i serum

- sluttpunkt fotometrisk

- reflekterende fotometri - tørrkjemi

De to første metodene er ekstremt ubeleilig, giftig og har lav nøyaktighet, så vi vil ikke dvele på dem.

Glukosoksidasemetode

I dag er metoder basert på bruk av enzymet glukoseoksidase mest brukt. Metoden er basert på følgende reaksjon:

På fig. Fig. 1 og 2 viser spekteret av arbeidsoppløsningen før og etter tilsetning av standard glukoseoppløsningen. Maksimal absorpsjon av reaksjonsblandingen - (reagens + glukose) ligger i området 500 nm. Følgelig er endringen i den optiske tetthet av den endelige reaksjon ved en bølgelengde på 480-520 nm proporsjonal med konsentrasjonen av glukose inneholdt i prøven.

Den høye populariteten til denne metoden for å bestemme glukose skyldes høy spesifisitet og enkel implementering. Metoden kan implementeres ved hjelp av et konvensjonelt fotometer (bedre enn et spesialisert biokjemisk fotometer som Mikrolab 540), eller ved hjelp av automatiske biokjemiske autoanalysatorer.

Sammen med endpointfotometrisk metode, for flere år siden, oppstod kits der den kinetiske fotometriske metoden ble implementert. Fremgangsmåten består i det faktum at i et visst forhold av glukoseoksydase og peroksydase-aktivitet, vil hastigheten for dannelse av farvede forbindelser for noen tid etter tilsetningen av prøven til arbeidsoppløsningen være proporsjonal med glukosekonsentrasjonen i prøven. Fordelen med denne metoden er at resultatet ikke er avhengig av nærværet av andre forbindelser i prøven, fordi absorpsjonen av den sistnevnte er stabile i tid. Denne metoden krever bruk av et kinetisk fotometer, for eksempel Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, halvautomatiske analysatorer, for eksempel Clima 15, eller automatiske biokjemiske analysatorer. Måling av glukosekonsentrasjon av fullblod kan hensiktsmessig utføres ved hjelp av anordninger, som er basert på amperometrisk måleprinsipp, ved hjelp av spesielle enzym sensorer. Hydrogenperoksid er en ekstremt ustabil kjemisk forbindelse, og den kan tjene som kilde til ladede partikler. Dette er det som brukes i enzym sensorer av membrantypen eller i de elektrokjemiske elementene av bærbare glukometre.

En prøve av helblod (vanligvis 20 μl) fortynnes i en systembufferløsning (røde blodlegemer ødelegges), og deretter tilføres gjennom en linje i en strømningscelle. Glukose, undergås oksidasjon under påvirkning av enzymet glukoseoksidase, plassert på membranen. Det resulterende hydrogenperoksidet diffunderer gjennom membranen og blir ytterligere oksidert i den katalytiske reaksjon under platinvirkningen. Spredningen av hydrogenperoksid på overflaten av platina danner en strøm som er proporsjonal med antall molekyler H₂Oh₂. Det således oppnådde signal behandles av anordningen ved den tilsvarende spenningsverdi. Denne målte verdien er proporsjonal med konsentrasjonen av glukose i prøven.

Som et eksempel på instrumenter som bruker metoden beskrevet ovenfor, kan vi nevne Biosens glukoseanalysatorer (Tyskland). Disse enhetene er praktiske for bruk ikke bare på sykehus, men også i polyklinikker, hvor glukosetesting utføres hovedsakelig fra kapillærblod.

Et viktig skritt i utviklingen av kliniske laboratoriediagnostiske metoder var fremveksten av "tørrkjemi". Naturligvis var en av de første anvendelsene av denne teknologien oppgaven med å bestemme glukosen i pasientens blod. De første enhetene var signifikant dårligere enn de tradisjonelle laboratorieforskningsmetodene. Imidlertid klarte en rekke bedrifter over tid å utvikle slike diagnostiske striper og reflekterende fotometre, noe som ga en meget høy nøyaktighet av analysen. One Touch glucometers og Life Scan (USA) teststrimler er mye populære over hele verden. De kombinerer den analytiske nøyaktigheten av den kvantitative enzymatiske metoden med hastigheten og enkelheten til "tørk kjemi".

One Touch blodglukemåler er utviklet for å raskt og nøyaktig måle glukosenivåene i helblod. One Touch-teststrimmelen inneholder alle nødvendige kjemiske komponenter for to-trinns glukoseoksidase-metoden, inkludert enzymene glukoseoksidase og peroksidase, som er adsorbert på en unik porøs hydrofil membran. Resultatet av reaksjonen er dannelsen av et farget kompleks. Intensiteten til den utviklede fargen registreres med et reflekterende miniphotometer.

Membranprøvebåndet One Touch ligner en svamp med mikroskopiske porer og utfører en trippelfunksjon. Det virker: 1) som et reservoar, samler den nødvendige mengden blod, 2) som et filter, blokkerer fast cellulært materiale (erytrocytter, leukocytter etc.), 3) som en glatt optisk overflate hvor det reflekterte lyset måles. Sistnevnte funksjon er spesielt viktig for driften av enheten. Det gjør det mulig å lese den nedre delen av stripen mens blodet forblir på oversiden av teststrimmelen. Følgelig er det ikke nødvendig å vaske blodet fra overflaten av teststrimmelen.

I tillegg har membranen hydrofile egenskaper, på grunn av hvilke en dråpe blod "tiltrekker seg" til overflaten av teststrimmelen når den berører.

Enheten One Touch inneholder to spesielle lysdioder. Behandlingen av den utviklede fargen på teststrimmelen er som følger. Så snart teststrimmelen er satt inn i enheten, oppstår en nulllesning. I øyeblikket på displayet ser vi: "VENT". Når en bloddråpe påføres teststrimmelen, blir blodplasmaet øyeblikkelig sorbert av membranen, mens erytrocyter og overflødig plasma forblir på overflaten av membranen. Etter fullstendig absorpsjon av en dråpe blod oppstår farvning umiddelbart. Enheten registrerer endringen i refleksjonens størrelse og starter automatisk timeren. Etter 45 sekunder, avsluttes den kjemiske reaksjonen, blir resultatet av lysrefleksjonen behandlet. Det fargede reaksjonsproduktet absorberer lyset som utløses av den første lysdioden. Blodceller og overflødig plasma absorberer også lyset som diode utsender. For å korrigere bakgrunnsrefleksjonen utføres andrelesingen av en andre LED med en annen bølgelengde. Forskjellen mellom signalene fra den første og den andre lysdioden gir informasjon om lysets absorpsjon av kromogenet. Signalet mottatt fra kromogenet for å anslå glukosekonsentrasjon er korrelert med en spesiell kalibrering. Alle One Touch-enheter er kalibrert ved hjelp av referansemetoden på laboratorieglukoseanalysator. Med denne prosedyren oppnås en standard kalibreringskurve. Det skal bemerkes at det er ganske vanskelig å etablere produksjon av teststrimler, som ville være helt det samme kjemisk, på grunn av den meget lave konsentrasjonen av reagenser. For å løse dette problemet, brukes en standard kalibreringskurve som består av 16 kalibreringslinjer. Kvalitetskontroll utføres umiddelbart etter produksjon av teststrimler, noe som gjør det mulig å bestemme hvilken av kalibreringslinjene (fra 1 til 16) som kan påføres på denne teststrimmelen. Dette er det såkalte kodenummeret, som er festet til teststrimmelpakken. Disse 16 kalibreringslinjene programmeres også i instrumentets mikroprosessor. For å oppnå optimalt nøyaktige resultater, er kodenummeret angitt på teststrimmelpakken satt inn i enheten ved hjelp av kodeknappen. En feilaktig installert kode på instrumentet kan dermed forårsake en målefeil.

Siden ankomsten av One Touch-enhetene på markedet har et stort antall kliniske studier gått i laboratoriene i Russland, Amerika og Europa. En av disse studiene ble utført av det endokrinologiske vitenskapelige senter for det russiske medisinske akademi på forespørsel fra den russiske sammenslutningen av medisinske laboratoriediagnostikk. Sentraspesialister gjennomførte en komparativ analyse av to metoder for måling av blodsukkernivå. Resultatene som ble oppnådd på One Touch ble sammenlignet med dataene oppnådd på Spectrum II biokjemisk analysator (Abbott Laboratories, USA), som implementerer heksokinase-metoden for bestemmelse av glukose. 190 blodprøver fra 95 pasienter ble undersøkt. Korrelasjonskoeffisienten til resultatene var 0,98641. Variasjonskoeffisienten i de normale og patologiske områdene på One Touch-måleren overstiger ikke 2,5%.

Den offisielle rapporten fra Endocrinological Research Center fra det russiske akademiske medisinske akademi sa: "One Touch-enheter har høy nøyaktighet og nøyaktighet, samt et bredt spekter av målinger. De kan brukes til å diagnostisere nødsituasjoner i diabetes, inkludert beredskapsteam, fordi disse enhetene ikke bare er pålitelige, men de gir også raskt resultater. "

Hexokinase metode

Registrering utføres ved en bølgelengde på 340 nm på absorpsjon av NADH. Denne metoden er svært spesifikk og reagerer ikke med andre komponenter i blodserum. Heksokinase-metoden anses som en referanse for glukosebestemmelse. Som regel er den lineær til 50 mmol / l, noe som tillot det å bli anbefalt til klinikker med endokrinologiske avdelinger.

Av de beskrevne forskjellige metoder for bestemmelse av glukose kan QDL-ansatte bestemme seg selv hvilken metode for bestemmelse og hvilken enhet som skal velges:

Metoder for "våt" biokjemi, implementert på automatiske biokjemiske analysatorer, vil gi laboratoriers behov en stor analyseflomme.
Biosentype-glukoseanalysatorer krever minimal innsats fra operatøren, da de er fullt automatiserte og tilstrekkelig produktive (hastighet fra 50 til 200 prøver per time).
For laboratorier med et lite antall studier, samt ekspreslaboratorier, er et spesialisert biokjemisk fotometer Mikrolab 540 praktisk.
For hjelpeteam er skjult hjelp den perfekte løsningen - blodglukemåler som One Touch.

Dermed er oppgaven med QDL for å sikre ikke bare rask, men også svært nøyaktig glukosebestemmelse, fullstendig løselig i dag.

Blodglukose, urin, brennevin

Blodglukose er strengt kontrollert.

Kontroll av glukosekonsentrasjon i blodet utføres av nerveinflammasjoner og hormoner.

Nervøs regulering

Den nervøse reguleringen av glukosekonsentrasjon i blodet uttrykkes i den positive effekten av n.vagus på insulinutspresjon og den hemmeffekten på denne prosessen med sympatisk innervering. I tillegg er frigivelsen av adrenalin i blodet underlagt sympatiske påvirkninger.

Hormonal regulering

De viktigste hormonelle reguleringsfaktorene er glukagon, adrenalin, glukokortikoider, somatotrop hormon på den ene side og insulin på den annen side. Alle hormoner, unntatt insulin, som påvirker leveren, øker glykemien.

Insulin er det eneste hormonet i kroppen som har som mål å senke blodsukkernivået. Med sin innflytelse absorberes glukose sterkt av muskler og fettvev.

Nedgangen i blodsukkerkonsentrasjonen ved insulin oppnås på følgende måter:

Overgangen av glukose til cellene - aktivering av GluT 4-transportproteiner på cytoplasmisk membran,
glukoseinnblanding i glykolyse - en økning i syntesen av glukokinase, et enzym som kalles glukosefelle, stimulering av syntesen av andre sentrale glykolysenzymer - fosfofruktokranase, pyruvatkinase,
økt glykogensyntese - aktivering av glykogensyntase og stimulering av dets syntese, noe som letter omdannelsen av overskudd av glukose til glykogen,
aktivering av pentosefosfatbanen - induksjon av syntesen av glukose-6-fosfatdehydrogenase og 6-fosfoglukonatdehydrogenase,
økt lipogenese - involvering av glukose i syntesen av triacylglyceroler eller fosfolipider.

Mange vev er helt ufølsomme overfor insulinvirkningen, de kalles insulin-uavhengige. Disse inkluderer nervevev, glasslegeme, linse, retina, glomerulære nyreceller, endotelceller, testikler og røde blodlegemer.

Glukagon øker blodglukosen:

økende glykogenmobilisering gjennom glykogenfosforylaseaktivering,
stimulerende glukoneogenese - øker arbeidet med enzymene pyruvat karboksylase, fosfoenolpyruvat karbokykinase, fruktose-1,6-difosfatase.

Adrenalin forårsaker hyperglykemi:

aktivering av glykogen mobilisering - stimulering av glykogen fosforylase,

Glukokortikoider øker blodglukosen

ved å undertrykke overgangen av glukose inn i cellen,
stimulerende glukoneogenese - øke syntesen av enzymer pyruvat karboksylase, fosfoenolpyruvat karbokykinase, fruktose-1,6-difosfatase.

Tabellen oppsummerer de viktigste aspektene av hormonelle påvirkninger:

Aktivering av glykogenolyse i leveren;
Stimulering av glukoneogenese;

Økt glukoneogenese;
Redusert membranpermeabilitet for glukose.

Blodglukose i klinisk praksis

Over 90% av alle oppløselige lavmolekylære blodkarbohydrater er glukose; i tillegg kan fruktose, maltose, mannose og pentose være tilstede i små mengder, og i tilfelle av patologi, galaktose. Sammen med dem i blodet inneholder polysakkarider assosiert med proteiner.

Spesielt intensivt glukose forbrukes og brukes til ulike behov i vevet i sentralnervesystemet, røde blodlegemer, medulla fra nyrene. I mellommetabolismen brukes glukose til å danne glykogen, glyserol og fettsyrer, aminosyrer, glukuronsyre og glykoproteiner. Konsentrasjonen av glukose i blodet er et derivat av glykolyse og oksydasjon av trikarboksylsyrer i TCA-syklusen, glykogenese og glykogenolyse i lever og muskelvev, glukoneogenese i lever og nyrer, og glukoseinntak fra tarmen.

I klinisk praksis blir blodsukkernivåene vanligvis undersøkt, konsentrasjonen av andre sukkerarter og glykogen brukes mye sjeldnere. I humant blod er glukose forholdsvis jevnt fordelt mellom plasma og dannede elementer; det er blitt fastslått at sukkerinnholdet i venøst blod er 0,25-1,0 mmol / l (i gjennomsnitt 10%) mindre enn i arterielt og kapillært blod. Definisjonen av melkesyre og pyrodruesyrer, aktiviteten til en rekke karbohydratmetabolismenzymer, sial- og heksuronsyrer, seromucoider, glykosylert hemoglobin og andre indikatorer er av kjent diagnostisk verdi.

Innholdet av glukose i urinen avhenger av konsentrasjonen i blodet, selv om den utskilles i både normale og forhøyede blodsukkernivåer. Med en økning i glukosekonsentrasjonen i blodet, blir den såkalte nyretærskelen overvunnet (hos friske mennesker ligger den i området 8,3-9,9 mmol / l) og glukosuri forekommer. Med arteriosklerotisk nyre, med diabetes øker terskelen, og glukosuri kan ikke observeres selv med en økning i glukosekonsentrasjon til 11,0-12,1 mmol / l.

Metoder for bestemmelse av blodsukker

Metoder for bestemmelse av blodsukker er delt inn i tre grupper: reduksjon, kolorimetrisk og enzymatisk.

Reduksjonsmetoder (Det bør huskes at metodene i denne gruppen gir overestimerte resultater (ca. 20-25%), siden blodet inneholder en rekke forbindelser som ikke er relatert til karbohydrater, men som har reduserende egenskaper (urinsyre, glutation, kreatinin, askorbinsyre syre)):
- Hagedorn-Jensens titrometriske metode er basert på sukkeregenskapen for å gjenopprette, når man kokker i alkalisk medium, jern-og-sinus og jernslammet kaliumsalter. I henhold til graden av denne utvinningen undersøkes konsentrasjonen av sukker i blodet ved hjelp av titrometri. En viktig fordel ved metoden er lavpris og mulighet for bruk i ethvert laboratorium;
- basert på reduksjonen av nitrobenzener, for eksempel pikrinsyre til pikraminsyre;
- metode basert på glukoses evne til å redusere kobbersalter. Det resulterende monovalente kobber virker som et mellomprodukt. Oksidert av luft oksygen, gjenoppretter det arsen-molybdinsyre eller fosforotungstic syre, som tjener som det endelige kromogenet.
Colorimetriske metoder. Disse inkluderer:
- Somodzhi metode - reduksjonsreaksjon av kobber, som er i sammensetningen av kobber-ortronreagens, til kobberoksid. Metoden er arbeidskrevende, multi-iscenesatt, ikke-spesifikk og praktisk talt ikke brukt for tiden;
- Folin-Wu-metode - reduksjon av kobbertartrat til litiumoksid. Metoden er enkel, ulempen er mangelen på streng proporsjonalitet mellom intensiteten av fargene oppnådd og konsentrasjonen av glukose;
- bestemmelse av glukosekonsentrasjon i henhold til Morris og Roe-dehydrering av glukose under påvirkning av svovelsyre og omdannelse til oksymetylfurfural, som kondenserer med en arthron til en blå forbindelse. Krever de reneste reagensene og streng overholdelse av den konstante reaksjonstemperaturen;
- Gultmans ortotoluidinmetode i modifikasjonen av Khivarinen-Nikkil, som består i å bestemme intensiteten av løsningsfargingen som oppstår når en aromatisk aminortolydin interagerer med aldehydgruppen av glukose i et surt medium. Denne metoden er nøyaktig og muliggjør en mer spesifikk bestemmelse av glukose.
- Anilinmetoden, beholder sensitiviteten til ortotoluidinmetoden, men er enda mer spesifikk.
Enzymatiske metoder:
- basert på heksokinasereaksjonen. Glukose under virkningen av heksokinas blir fosforylert av ATP, den resulterende Gl-6-F i nærvær av dehydrogenase gjenoppretter NADP. Mengden av sistnevnte bestemmes av økningen i lysabsorpsjon i det ultraviolette området. Metoden er for dyr for praktiske laboratorier.
- basert på oksydasjon av glukose til glukuronsyre ved bruk av enzymet glukoseoksidase og dannelsen under reaksjonen av hydrogenperoksid, hvilken (i forskjellige versjoner):
  - bestemt av kjemiske midler;
  - med deltagelse av peroksidase, oksiderer den fargeløs orthotolidin, gjør den til en grønnblått fargestoff, rettigheten av fargebenholdet av glukosekonsentrasjon forblir i området fra 1,1 til 22 mmol / l;
  - i nærvær av fenol med deltagelse av peroksidase oksyderer 4-aminoantipyrin til en farget krystallklart fargede forbindelse;
  - I nærvær av kobberioner oksiderer det fenolftalin til fenolftalein, som er farget rødt under alkaliske forhold.
Elektrokjemiske metoder som bruker elektroder som inneholder immobiliserte enzymer, spesielt glukoseoksidase. Reaksjonen registreres ved mengden hydrogenperoksid dannet eller ved tap av oksygenforbruk for oksydasjon av glukose.
Diagnostiske striper ved bruk av glukoseoksidase-peroksidase-reaksjonen og benzidin-derivater som kromogenet.

Tre metoder ble vedtatt som forenet: Haggedorn-Jensen titrometrisk metode, orto-toluidinmetoden og o-tolidin-glukosoksidasemetoden.

Bestemmelse av glukose ved ortotoluidinmetoden

prinsippet

Glukose når den oppvarmes med orthotolude i nærvær av svovelsyre gir en blågrønn farge.